三斑海馬酶解工藝的優化及其液化蛋白對DPPH·的清除作用

袁學會，陳成波，陳 政，易美華，*

(1.海南大學，海南海口570228;2.海南壹號藥業有限公司，海南海口570311)

三斑海馬酶解工藝的優化及其液化蛋白對DPPH·的清除作用

袁學會1，陳成波2，陳 政2，易美華1，*

(1.海南大學，海南海口570228;2.海南壹號藥業有限公司，海南海口570311)

為了優化三斑海馬酶解工藝并對其液化蛋白進行抗氧化研究，本文采用酶法工藝對三斑海馬進行液化蛋白的提取，以酶解率為指標，采用了4組單因素實驗、16組正交實驗進行優化，以DPPH自由基的清除率來衡量三斑海馬液化蛋白的抗氧化活性。實驗結果表明，三斑海馬在使用堿性蛋白酶，料液比1∶10、反應時間6h、酶用量1%時提取的液化蛋白水解率最高;三斑海馬液化蛋白具有較高的抗氧化活性，對DPPH·的IC50為0.07mg/mL，高于維生素C。

三斑海馬，酶解率，DPPH法，抗氧化活性

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海馬 購自海口廣安堂大藥房，經認定為三斑海馬;堿性酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶 無錫市杰能科生物科技有限公司;DPPH Sigm公司，分析純;維生素C、無水乙醇、四氯化碳、氫氧化鉀、酒石酸鉀鈉、硫酸銅(CuSO4·5H2O)等其它試劑 均為分析純。

722分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司;分析天平 上海良平儀器儀表有限公司;雷磁pH計上海精科儀器有限公司;HH-S26S電熱恒溫水浴鍋 金壇市大地自動化儀器廠;JB90-D型強力電動攪拌機 上海標本模型廠;移液槍 美國熱電公司(Thermo)。

1.2 實驗方法

1.2.1 檢測項目和方法

1.2.1.1 液化蛋白的測定 以牛白蛋白為樣，先以凱氏定氮法核準牛白蛋白中蛋白質含量，再通過雙縮脲法進行測定蛋白質標準曲線(使蛋白質含量在40～110mg之間)，得到回歸方程y=0.0046x+0.0845，R2=0.9977，表明在此范圍內呈良好的線性。

1.2.1.2 酶解率的測定

酶解率DH(%)=酶解液中可溶性蛋白/55.6% A×100%

式中:55.6%為海馬蛋白質對海馬干基相關系數;A為海馬干基質量。

1.2.1.3 抗氧化活性的測定［8-10］

作用模式:AH+DPPH·—→DPPH-H+A·

稱取DPPH試劑12.80mg，用50%乙醇溶解，定量轉入50mL容量瓶中，并定容至刻度，搖勻得濃度為256.1mg/L DPPH儲備液(約6.5×10-4mol/L)，用錫紙包好，置于冰箱中冷藏備用。使用前用50%乙醇稀釋至濃度為25.61mg/L(約6.5×10-5mol/L)。

將6.5×10-5mol/L的DPPH·溶液室溫下靜置10min后放入分光光度計中對DPPH溶液進行600～400nm可見光區掃描，得其吸收光譜在可見光區λ= 517nm處有最大吸收峰位。所以本研究以波長517nm的吸光度來表示DPPH含量的變化。

測定樣品自由基清除能力時，將樣品液同樣配制為50%乙醇，并且準備不同多肽濃度的樣品液，分別按照表1加入反應液。

表1 試樣加樣表

將Ai所表示的樣品室溫下反應30min后，在分光光度計517nm處測定各吸收值(A0、Ai、Aj)，每個濃度重復3次，求得清除率平均值。

樣品對 DPPH自由基清除能力(scavenging activity，SA)計算公式如下:

SA(%)=1-(Ai-Aj)/A0×100%

抗氧化劑清除DPPH自由基能力采用半清除率值(IC50)表示。測定樣品液濃度與DPPH自由基清除率，并繪制DPPH自由基清除率對樣品液濃度的曲線，通過方程計算清除率為50%時所需樣品液的濃度，即為IC50值。

1.2.2 工藝流程 三斑海馬→烘干→剪碎→酶解→測定液化蛋白含量→配制DPPH試劑→測定抗氧化活性

1.2.3 正交實驗 通過4組單因素實驗得到了不同條件對三斑海馬酶解率的影響規律，如表2所示，根據結果設計L16(43)正交實驗，以期獲得最佳工藝條件以及各個因素的主次順序。

表2 實驗因素水平表

2 結果與討論

在三斑海馬液化蛋白提取工藝研究中，以酶解率的高低為考察因素，先通過單因素實驗考察不同條件對三斑海馬酶解率的影響規律，再通過正交實驗得出提取的最佳工藝組合以及各個因素的主次順序。

2.1 海馬酶解的工藝優化

2.1.1 酶類型的選擇 選擇胰蛋白酶、堿性酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶四種酶在料液比1∶15，時間6h，加酶量1%，并分別在最佳pH和溫度下進行反應(見表3)，結果如圖1所示。

表3 不同酶的最佳pH和溫度

圖1 酶類型對酶解率的影響

由圖1可知，在上述條件下，海馬酶解率的高低順序是:堿性酶＞胰蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞胃蛋白酶，堿性酶與胃蛋白酶的酶解率相差甚遠，堿性酶的酶解率高達54.4%，因此，選擇堿性酶對海馬進行酶解。

2.1.2 料液比的選擇 選擇堿性酶，在溫度60℃，pH9.5，加酶量1%，酶解時間6h的條件下，將料液比分為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20四個梯度，每隔1h測一次酶解率，以時間為橫坐標，酶解率為縱坐標作圖，結果如圖2所示。

由圖2可知，當料液比為1∶5時，酶解速率慢，終點值低，當料液比為1∶10、1∶15、1∶20時，海馬酶解率曲線基本一致，速率比較快，終點值也幾乎重合。

實驗表明，當料液比大時，底物濃度過高，分散不均勻，過多底物分子堆集于酶的活動中心，從而會影響催化速度及產物分子的擴散，故酶解率較低;料液比過大的話，一方面雖然使底物分散更均勻，溶解度增加，溶液中相對可溶性蛋白質含量低，為以后的濃縮等帶來麻煩，故選擇料液比要綜合考慮。

圖2 料液比對海馬酶解率的影響

2.1.3 酶解時間的選擇 選擇堿性酶，在溫度60℃，pH9.5，料液比1∶10，加酶量1%時，酶解9h，每1h測酶解率與pH，觀察酶解率與時間和pH之間的變化關系，結果如圖3顯示。

圖3 pH和酶解率與海馬酶解時間關系對照圖

由圖3可知，海馬在堿性酶酶解過程中，pH隨時間的延長而降低，酶解率隨時間延長而升高，并都在時間為5h時減緩或者終止變化。蛋白質與pH呈反比關系，可能是因為海馬酶解出的可溶蛋白暴露出來的羧基比氨基要多，所以溶液pH緩慢降低，直至反應終止。

2.1.4 酶用量的選擇 選擇堿性酶，在溫度60℃，pH9.5，料液比1∶10，酶解時間為5h的條件下，將加酶量分為0.5%、1%、1.5%、2%四個梯度，以時間為橫坐標、酶解率為縱坐標作圖，結果如圖4所示。

圖4 酶用量對海馬酶解率的影響

由圖4可知，當加酶量最低為0.5%時，酶解率曲線起點和終點都比較低，曲線平緩上升，當加酶量為1%、1.5%、2%時，起點值略有不同，曲線軌跡平緩上升，但是終點值幾乎一樣，說明此時酶用量的不同對酶解率的最終結果影響不大。

2.1.5 海馬液化蛋白酶解正交實驗 通過設計L16(43)正交實驗(表2)以確定提取海馬液化蛋白最佳酶解工藝。由表4可知，提取海馬液化蛋白最佳酶解工藝為A2B3C2，即料液比1∶10、反應時間6h、酶用量1%，在此條件下酶解率最高，達到67%。

表4 海馬液化蛋白酶解正交實驗結果

在本實驗中，RB＞RA＞RC，所以各個因素的主次順序為:B(反應時間)＞A(料液比)＞C(酶用量)。

2.2 海馬液化蛋白的抗氧化研究

2.2.1 海馬液化蛋白對DPPH自由基的清除作用

根據正交實驗所得的最佳工藝對海馬進行酶解，得到海馬液化蛋白酶解液，測得酶解率為67%。根據1.2.1.3所述，將酶解液稀釋，配制成多個不同多肽濃度的樣液，分別測定，得到海馬液化蛋白對DPPH自由基清除作用的影響曲線，如圖5所示。

圖5 海馬液化蛋白對DPPH自由基清除作用的影響

由圖5可知，隨著海馬液化蛋白濃度的升高，其對自由基清除率也逐漸升高，并且曲線有一個明顯拐點，拐點前7個點的海馬多肽濃度從0.0014mg/mL升到0.35mg/mL，自由基清除率從4.2%升至75.59%，X軸點與點之間密集，Y軸變化劇烈，但拐點后5個點X軸點與點間距較大，Y軸變化較小，說明當海馬多肽濃度比較小時對自由基清除率的影響較大，但達到一定濃度時海馬多肽對自由基清除率的影響變小。

當對DPPH自由基清除率為50%時海馬液化蛋白的濃度為0.07mg/mL，即IC50=0.07mg/mL。

為了對海馬液化蛋白的抗氧化性進行直觀的評價，我們選擇常用抗氧化劑維生素C做比較，測得維生素C的IC50=0.331mg/mL，即維生素C在同等條件下對DPPH自由基的清除率為50%時，海馬液化蛋白的抗氧化能力是維生素C的4.73倍，具有較強的抗氧化性。

3 結論

3.1 三斑海馬液化蛋白提取的最佳條件是，選擇堿性酶、pH為9.5、溫度60℃、料液比1∶10、反應時間6h、酶用量1%，此時三斑海馬酶解率高達67%，為最佳工藝。各個因素的主次順序為:B(反應時間)＞A (料液比)＞C(酶用量)。

3.2 通過DPPH法以維生素C為對照對三斑海馬液化蛋白的抗氧化活性進行的考察表明，三斑海馬液化蛋白具有較強的抗氧化能力，同等條件下比抗氧化劑維生素C要強4.73倍。

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Study on optimization of enzymatic and the antioxidant activity to DPPH·of liquid protein of Three-spot hippocampus

YUAN Xue-hui1，CHEN Cheng-bo2，CHEN Zheng2，YI Mei-hua1，*
(1.Hainan University，Haikou 570228，China; 2.Hainan No.1 Pharmaceutical Company Limited，Haikou 570311，China)

In order to study on optimization of enzymatic and the antioxidant activity of liquid protein of Three-spot hippocampus，extraction of soluble protein by enzyme，used 4 single-factor experiment and 16 groups of orthogonal to optimization，measured three-spot hippocampus antioxidant activity of liquid protein by the clear rate to DPPH.The results indicated:when we use alkaline protease，Liquid ratio 1∶10，reaction time 6h，1%enzyme dosage the soluble protein hydrolysis was highest;Three-spot hippocampus antioxidant activity of liquid protein was high，the IC50was 0.07mg/mL，higher than the vitamin C.

Three-spot hippocampus;hydrolysis rate;DPPH method;antioxidant activity

TS254.1

B

1002-0306(2011)09-0291-04

海馬異名為水馬(《抱樸子》)，鯫姑(《海南介語》)，龍落子、馬頭魚(《動物學大辭典》)。為海龍科，品種有線紋海馬 Hippocampus Kelloggi Jordan et Snyder、刺海馬 Hippoxamoud kuda Bleeker、三斑海馬Hippocampus trimaculatus Leach 、 小 海 馬Hippocampusjaponicus Kaup等，是珍貴的海產魚類，被譽為“南海人參”。海馬中含有大量的生理活性物質，有著很高的藥用價值［1-2］。近年來國內外研究表明，海馬水、醇提取物具有促進小鼠抗應激，增強小鼠的記憶能力，增加小鼠血中的SOD含量，降低小鼠肝中的過氧化脂質(LPO)的含量(即降血脂作用)，抑制小鼠腦內MAO-B活性及促進血液流變學改變和改善微循環的作用［3］;斑海馬具有明顯的抗血栓藥理作用，能明顯抑制大鼠實驗性頸動脈血栓和大鼠腦血栓的形成，為海馬疏氣活血功效提供理論依據［4］。大海馬、海馬、剌海馬、斑海馬、三斑海馬的提取物，對L-谷氨酸致大鼠神經元鈣內流有明顯的抑制作用，鈣離子進入神經元在興奮性氨基酸L-谷氨酸致神經無潰變和壞死過程中起重要作用［5］。DPPH (1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl即 1，1-二苯-2-苦肼基)由于苯環的共軛和位阻及硝基的電子作用，是一種穩定的自由基，其乙醇溶液呈紫色，當DPPH溶液中加入自由基清除劑時，DPPH的單電子被配對而使其紫色變淺，吸收光度變小，而吸收光度變小的程度與自由基被清除的程度呈線性關系［6-7］，因此用其來檢測自由基清除情況，以判斷三斑海馬液化蛋白的抗氧化能力，為合理開發海馬提供理論依據。

2010-11-30 *通訊聯系人

袁學會(1986-)，男，在讀研究生，研究方向:資源開發與利用。

海口市重點科技計劃項目(2009-019)。