苯丙氨酸添加下酪蛋白類蛋白反應修飾物的抗氧化性質

岳 楠，趙新淮

（乳品科學教育部重點實驗室，東北農業大學，黑龍江哈爾濱150030）

苯丙氨酸添加下酪蛋白類蛋白反應修飾物的抗氧化性質

岳 楠，趙新淮*

（乳品科學教育部重點實驗室，東北農業大學，黑龍江哈爾濱150030）

采用木瓜蛋白酶水解酪蛋白制備水解度為9.6%、DPPH·清除率為38.7%的水解物，添加苯丙氨酸于水解物并利用響應面法優化木瓜蛋白酶催化的類蛋白反應條件。在反應時間固定為5h下得到適宜的條件為：溫度30℃、底物濃度50%（w/v）、酶添加量3kU/g蛋白質、氨基酸添加量0.74mol/mol水解物游離氨基。此條件下分別制備出5個修飾產物，以不添加苯丙氨酸的修飾產物或水解物和苯丙氨酸混合物為對照，評價它們的抗氧化活性。結果表明，與酪蛋白水解物或混合物或不添加苯丙氨酸的修飾產物相比，添加苯丙氨酸的修飾產物的DPPH·清除能力、還原能力和·OH清除能力顯著提高；但是抗氧化性質與所采用的氨基酸添加量、反應時間之間的關系不顯著。

酪蛋白水解物，苯丙氨酸，木瓜蛋白酶，類蛋白反應，抗氧化活性

1 材料與方法

1.1 材料與設備

酪蛋白 蛋白質含量86.1%，北京奧博星生物技術有限公司；木瓜蛋白酶 國藥集團化學試劑有限公司，酶活力2.25×104U/g；1，1-二苯基-2-苦基苯肼（DPPH） Sigma公司；鐵氰化鉀 天津市博迪化工有限公司；苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽、酪氨酸甲酯鹽酸鹽、α-脫氧核糖 阿拉丁試劑股份有限公司；其他所有試劑 均為分析純。

UV-2401PC型紫外可見分光光度計 日本島津公司；AL204型分析天平、DELTA 320型精密pH計梅特勒-托利多儀器中國有限公司；LGJ-1型真空冷凍干燥機 上海醫用分析儀器廠；HZQ-F160型全溫振蕩培養箱 哈爾濱東聯電子技術開發有限公司；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；LG-21M高速冷凍離心機 上海市離心機械研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 酪蛋白水解物的制備 配制濃度為5%（w/v）的酪蛋白溶液，調節pH至6.5，加入木瓜蛋白酶1500U/g蛋白質，45℃恒溫水浴中水解1～5h；水解結束時調節pH至4.6，100℃加熱20min，然后5000r/min離心20min，收集上清液。分別測定各上清液的蛋白質含量和游離氨基含量，計算其水解度與蛋白質收率；然后測定上清液對DPPH·自由基的清除能力。綜合分析確定水解物的適宜制備條件，大批制備后真空冷凍干燥，于-20℃保藏。

1.2.2 酪蛋白水解物的類蛋白反應條件優化 采用中心組合實驗，固定反應時間5h，通過測定反應體系的游離氨基含量減少量變化（底物游離氨基含量減去修飾產物游離氨基含量），利用響應面法對溫度、底物濃度、酶添加量、氨基酸添加比例4個因素進行優化，其因素水平編碼見表1，以選擇適宜的修飾反應條件。反應結束后，修飾產物在沸水浴滅酶15min，冷卻后測定游離氨基含量。

表1 響應面分析的因素水平編碼表

1.2.3 測定方法

1.2.3.1 蛋白質含量、水解度及蛋白酶活力的測定

a.蛋白質含量測定：凱氏定氮法[13]。

b.游離氨基含量及酪蛋白水解度（DH）測定：鄰苯二甲醛（OPA）法[14-15]。

OPA試劑：稱取2.00g十二烷基磺酸鈉（SDS），加入30mL 0.4mol/L的硼酸緩沖溶液（pH9.5），水浴加熱使其完全溶解，冷卻至室溫后再加入1mL 80mg/mL的OPA乙醇溶液和200μL β-巰基乙醇，并用硼酸緩沖溶液定容至100mL。

游離氨基含量測定：將亮氨酸配制成不同濃度的標準溶液（0～30μg/mL），取3mL標準溶液與同體積的OPA試劑混合并開始計時，5min后在分光光度計上340nm波長下測定。以吸光值為橫坐標，亮氨酸濃度為縱坐標繪制標準曲線。按照標準曲線制作步驟，測定分析樣品的吸光值，并根據標準曲線回歸方程計算其游離氨基含量。水解度的計算[16]如下，其中0.6mol/g為酪蛋白的游離氨基含量。

c.蛋白酶活力測定：福林酚法[17]。

d.蛋白質收率（%）：酪蛋白的蛋白質質量與酪蛋白水解物的蛋白質量的比值。

1.2.3.2 DPPH·自由基清除活性[18]稱取DPPH粉末0.0079g，用無水乙醇溶解，定容至100mL，配制成20μmol/L的DPPH乙醇溶液，放置于棕色瓶中，暗處保存。將樣品溶液適當稀釋，使分析時其吸光值在0.7以下。吸取1mL DPPH乙醇溶液與2.00mL 1mg/mL的樣品溶液在具塞試管中混合，室溫下暗處放置30min后，測定其在517nm處的吸光值，同時利用無水乙醇進行空白實驗。DPPH自由基清除率的計算方法如下：

式中：A517空白為空白樣在517nm處的吸光值，A517樣品為分析樣在517nm處的吸光值。1.2.3.3 還原能力[19]取2mL 0.2mol/L磷酸鈉緩沖液（pH6.6）與2mL 1%鐵氰化鉀溶液混合，加入2mL樣品，使樣品終濃度為2mg/mL，50℃保溫30min，冷卻并加入2mL 10%的三氯乙酸；取2mL上清液加入2mL蒸餾水和0.4mL 0.1%氯化鐵，混合均勻；反應10min后在700nm測定吸光度。吸光值越大，說明樣品還原能力越強。

1.2.3.4 羥自由基清除能力[20]取0.20mL FeSO4-EDTA混合液（10mmol/L）于試管中，加入0.50mL的脫氧核糖溶液（10mmol/L）、0.90mL磷酸緩沖液（pH 7.4，0.1mol/L）、0.20mL的樣品溶液、0.20mL H2O2（10mmol/L），混合后置于37℃恒溫水浴中反應1h，然后加入2.8%（w/w）三氯乙酸溶液1.00mL、1.0%（w/w）硫代巴比妥酸溶液1.00mL，混勻后沸水浴反應15min，冷卻后在532nm處測吸光度A1。測定空白樣時，不加樣品同上操作處理，吸光值為A0。羥自由基清除能力（SA）如下式表示：

1.3 數據的統計分析

采用Excel 2003軟件，SPSS 13.0軟件和Design Expert 7.0軟件對數據進行處理、繪圖、統計分析。

2 結果與討論

2.1 酪蛋白水解物的制備

采用木瓜蛋白酶、添加量為1.5kU/g、溫度45℃，對酪蛋白進行水解。水解時間為1～5h時，酪蛋白水解物水解度、DPPH·清除率如圖1所示，蛋白質收率則分別為79.9%、80.8%、81.7%、82.3%、82.9%。

圖1 水解時間對酪蛋白水解物水解度、DPPH·清除率的影響注：折線圖為水解度，柱狀圖為DPPH·清除率（濃度1mg/mL）。

在反應時間2h時，水解物的DPPH·清除活性較好，并且蛋白質回收率也較高，所以水解物的反應時間選擇2h，制備樣品進行下一步研究。所制備的酪蛋白水解物在樣品蛋白質濃度1mg/mL時，對DPPH·清除率為38.7%、水解度為9.6%。有研究對比了五種蛋白酶水解牦牛酪蛋白水解后得到水解物的抗氧化性，結果發現這些水解物在濃度為2.5mg/mL時，對DPPH·自由基的清除率均不高于80%[21]。另外，在Ali[22]等人的研究中利用胃蛋白酶水解的肌肉蛋白質，得到的水解物濃度為1mg/mL時，其DPPH·清除率不超過40%。因此，從這些結果可以看出，本研究選擇的酪蛋白水解物具有較強的抗氧化活性，可作為下一步研究的原料。

2.2 酪蛋白水解物的類蛋白反應條件優化

固定反應時間為5h，采用四因素五水平響應面方法（共30組實驗），以反應體系游離氨基減少量為響應值Y，利用Design-Expert軟件進行二次多項回歸擬合，獲得游離氨基減少量（Y）與溫度（X1）、底物濃度（X2）、酶添加量（X3）、氨基酸添加比例（X4）關系的二次多項式回歸方程為：

軟件分析結果表明，所得模型顯著（P＜0.0001），模型的校正確定系數R2Adj=0.9053，表明模型能很好地反映出類蛋白反應過程中游離氨基含量變化。圖2為應用Design Expert 7.0所作的響應面曲面圖，可以得到以下結論：a.隨著底物濃度和溫度的提高，反應體系游離氨基減少量逐漸提高，在溫度和底物濃度分別達到30℃和50%時，體系中的游離氨基減少量達到最大，隨后逐漸降低；b.隨著酶添加量的增加，反應體系中的游離氨基減少量逐漸增加，當酶添加量達到3kU/g蛋白質時，體系中的游離氨基減少量達到較大值；c.隨著苯丙氨酸的添加量逐漸增加，反應體系中游離氨基減少量逐漸增加，苯丙氨酸添加量為0.74mol/mol水解物游離氨基時，體系中游離氨基減少量也最大。綜合分析，得到苯丙氨酸存在條件下酪蛋白水解物的適宜類蛋白反應條件為：在反應時間為5h時，溫度30℃、底物濃度50%、酶添加量3kU/g蛋白質、氨基酸添加量0.74mol/mol水解物游離氨基。

圖2 酪蛋白水解物類蛋白反應修飾時各因素對游離氨基減少量的影響

表2 類蛋白反應修飾對酪蛋白水解物抗氧化活性的影響

2.3 修飾產物的抗氧化活性變化

在上述優化條件下對酪蛋白水解物進行類蛋白反應修飾，并分別變化反應時間、苯丙氨酸添加量，制備出5個不同程度的修飾產物（修飾產物2～6），測定其游離氨基減少量及三個抗氧化性質。對照樣則為酪蛋白水解物、水解物與苯丙氨酸的混合物（混合物1～2）和未添加苯丙氨酸進行類蛋白修飾反應的修飾產物1。最終的抗氧化性質評價結果如表2。

總體上看，可以發現：a.酪蛋白水解物中直接混入較高水平（例如0.74mol/mol）的苯丙氨酸，可以一定程度提高混合物的抗氧化性；b.酪蛋白修飾產物1～6均顯示出比水解物、混合物更好的抗氧化性質，說明是類蛋白反應修飾改善了酪蛋白水解物的抗氧化性質；c.添加苯丙氨酸時進行類蛋白反應修飾，酪蛋白修飾產物的抗氧化活性更好，因為修飾產物2～6的抗氧化性質（例如DPPH·清除能力、還原能力）一般均好于修飾產物1；d.在添加相同水平苯丙氨酸時，反應時間對修飾產物的抗氧化性質的影響不大，因為修飾產物2、3、4之間以及修飾產物5、6之間的整體差異不大；e.苯丙氨酸添加量的高低，對修飾產物2～6抗氧化活性的影響也不顯著；f.在酪蛋白水解物類蛋白反應中加入苯丙氨酸，可以提高酪蛋白水解物的抗氧化性質，但修飾產物的游離氨基減少量與抗氧化活性提高，也不存在明顯的相關性。

在Anusha[23]關于鱈魚蛋白質水解物抗氧化活性的研究中，其樣品在濃度為3mg/mL時DPPH·最大清除率為61.3%，在測定還原能力時樣品終濃度為3mg/mL（相當于蛋白質濃度9mg/mL），還原能力不超過0.603，不難看出，本研究制備的修飾產物具有較高的DPPH·清除率及還原能力。另外，木瓜蛋白酶參與下的酪蛋白水解物樣品濃度為26.80mg/mL，其羥自由基清除率為71.28%[24]，此結果與我們的研究結果相似。

3 結論

3.1 利用木瓜蛋白酶水解酪蛋白，通過水解度、蛋白回收率、DPPH·清除率等方面評價，選擇反應時間為2h的水解產物為類蛋白反應的底物，此水解物的水解度為9.6%、DPPH·清除率為38.7%。

3.2 通過響應面分析法，苯丙氨酸存在下木瓜蛋白酶催化酪蛋白水解物類蛋白反應的適宜條件為：反應時間固定為5h，反應溫度30℃、底物濃度50%（w/w）、酶添加量3kU/g蛋白質、氨基酸添加量0.74mol/mol水解物游離氨基。

3.3 不添加氨基酸的類蛋白反應可以改善酪蛋白水解物的DPPH·清除能力、還原能力、·OH清除率，而添加苯丙氨酸的類蛋白修飾產物能夠進一步提高酪蛋白水解物的這些抗氧化性質，并且在添加苯丙氨酸后修飾產物的抗氧化性質與氨基酸添加量、反應時間之間的關系不明顯。

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In vitro antioxidant activity of the casein hydrolysates modified by plastein reaction in the presence of phenylalanine

YUE Nan,ZHAO Xin-huai*
（Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China）

Papain was used to hydrolyze casein to prepare casein hydrolysates with a degree of hydrolysis of 9.6%and a scavenging activity on DPPH·radical of 38.7%.Phenylalanine was added into the hydrolysates to carry out a plastein reaction catalyzed by papain.When reaction time was fixed at 5h，response surface method was used to optimize plastein reaction conditions，which were selected as follows:reaction temperature 30℃，substrate concentration of 50% (w/v)，enzyme addition 3kU/g proteins，phenylalanine addition 0.74mol/mol free amino groups of the hydrolysates.Five modified casein hydrolysates were thus prepared and evaluated for theirantioxidantproperties，with the originalcasein hydrolysates，mixture ofcasein hydrolysates and phenylalanine，modified casein hydrolysates without phenylalanine addition as controls.The evaluation results showed that the modified casein hydrolysates had better antioxidant properties including scavenging activity on DPPH·radical or hydroxyl radical and reducing powder，compared to these controls.It was also found that the improved antioxidant properties of the modified casein hydrolysates were not related to the reaction time and phenylalanine addition applied in the preparation.

casein hydrolysates；phenylalanine；papain；plastein reaction；antioxidant activity

TS201.2

A

1002-0306（2011）10-0099-05

對自由基的研究是生命科學中的重點領域，研究發現機體的疾病和衰老等與自由基之間存在內在關系[1-3]。蛋白質酶水解得到的抗氧化活性肽，能有效地清除活性氧自由基[4-5]，具有潛在的生理調節作用，保護細胞和線粒體的正常結構和功能[6]。因此，抗氧化肽的研究成為當前的研究熱點。類蛋白反應通常是指在一定條件下，通過蛋白酶的催化作用將高濃度的蛋白質水解物與蛋白酶一起加熱處理，生成一種類似高分子蛋白質物質的反應。通過類蛋白反應合成的類似蛋白質的物質，可提高蛋白質的營養功能和加工特性，提高蛋白產品的附加值，滿足食品工業對蛋白質的功能特性和營養價值日益提高的要求[7-9]。已有研究表明，蛋白質水解物的類蛋白反應可以提高其抗氧化性質[10-11]；酪氨酸的添加也可以改善酪蛋白類蛋白反應修飾產物的抗氧化性質[12]。為此，本研究通過木瓜蛋白酶水解酪蛋白制備出酪蛋白水解物，然后添加苯丙氨酸并利用木瓜蛋白酶對水解物進行類蛋白反應修飾，考察修飾產物的抗氧化性質變化，揭示氨基酸添加對酪蛋白類蛋白修飾產物的抗氧化活性影響。

2011-07-18 *通訊聯系人

岳楠（1986-），女，在讀碩士研究生，研究方向：食品科學。

國家自然科學基金（30972132）；黑龍江省高等學校科技創新團隊建設計劃項目（2010td11）。