牛初乳中IGF-I提取物對腸黏膜修復作用的研究

呂劍光，宋 偉，霍貴成

（乳品科學教育部重點實驗室，東北農業大學，黑龍江哈爾濱150030）

牛初乳中IGF-I提取物對腸黏膜修復作用的研究

呂劍光，宋 偉，霍貴成﹡

（乳品科學教育部重點實驗室，東北農業大學，黑龍江哈爾濱150030）

目的：研究牛初乳中胰島素生長因子-I（IGF-I）對大鼠受損腸黏膜的修復作用。方法：應用氨甲喋呤制備大鼠小腸炎模型，實驗設正常對照組，MTX模型對照組 （20μg/kg），牛初乳IGF-I提取物修復組 （75μg/kg），IGF-I修復組（75μg/kg）。后2組每天灌胃給藥1次，給藥時間從造模后第2d開始至實驗結束，共5d。第6d檢測大鼠血漿二氨氧化酶（DAO）活性、血漿D-乳酸水平，光鏡下觀察小腸組織病理形態學改變。結果：與對照組相比，模型組大鼠血漿DAO活性和血漿D-乳酸水平明顯升高（P＜0.05），小腸損傷程度明顯高于對照組（P＜0.05），牛初乳中IGF-I提取物組和IGF-I組可降低血漿DAO活性及D-乳酸水平（P＜0.05），減輕小腸損傷程度（P＜0.05）。結論：牛初乳中IGF-I提取物能夠明顯減輕大鼠腸黏膜的損傷，同時可減輕炎細胞的浸潤，對實驗性大鼠的小腸炎具有修復作用。

牛初乳，胰島素生長因子，腸黏膜/損傷

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗動物 健康Sprague-Daw Ley（SD）大鼠（清潔級）20只，雄性，體質量（200±20）g，購于川北醫學院，動物購進后在本校生命院動物房飼養適應一周后投入實驗；牛初乳 胎次2～5次，榨乳時間為分娩后24h；human IGF-I Peprotech，MTX，DAO標準品，D-乳酸標準品 sigma。

DU800型核酸/蛋白質分析儀 BECKMAN COULTER。

1.2 實驗方法

1.2.1 牛初乳中IGF-I提取 初乳經離心后使之脫脂，將脫脂乳凝乳后離心，取上清液即得乳清，采用強陽離子交換樹脂SPFF用于捕獲乳清中IGF-I，即得IGF-I提取物[4]。

1.2.2 模型建立 大鼠適應一周后，腹膜腔內注射MTX（20μg/kg體重），造成小腸炎[5]，傷后6d處死大鼠，進行指標分析。

1.2.3 分組及評定 實驗設正常對照組，MTX模型對照組，牛初乳IGF-I提取物修復組（75μg/kg）及IGFI修復組（75μg/kg），每組5只大鼠。后兩組從造模后第24h開始，按劑量腹膜腔內注射1次/d進行干預。

1.2.4 測定方法

1.2.4.1 血漿二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO)活性向潔凈試管中加入0.2mol·L-1PBS 3mL（pH7.2），辣根過氧化物酶0.1mL（4μg），鄰聯茴香胺0.1mL（500μg），血漿0.5mL，最后加尸胺0.1mL（175μg），充分混勻后置37℃水浴30min。測定波長為436nm[6]。

1.2.4.2 血漿中D-乳酸水平 以改良Brandt等方法測定血漿D-乳酸濃度[7]。

1.2.4.3 腸道組織病理學檢查 將回腸末端組織固定于中性福爾馬林溶液中，常規脫水，石蠟包埋，切片HE染色后光鏡下觀察組織學變化。小腸損傷程度用Park等報道的積分法評估[8]。0分為正常黏膜；1分為絨毛頂部上皮下產生間隙；2分為上皮下間隙擴大；3分為上皮部分絨毛脫落；4分為絨毛脫落明顯；5分為絨毛消失；6分為隱窩組織形成梗死；7分為轉化粘液質形成梗死；8分為透壁梗死。

1.2.5 數據分析 實驗數據重復測定5次(n=5)，采用SPSS13.0統計軟件進行分析。計量數量以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 血漿DAO活性

實驗中發現，腸道損傷可使血漿DAO活性明顯升高，與對照組相比，有顯著差異（P＜0.05）（見圖1）。與MTX模型組比較，牛初乳IGF-I提取物組和IGF-I組血漿中DAO活性較低（P＜0.05）。牛初乳IGF-I提取物組同IGF-I組沒有顯著差異（P＞0.05）。說明牛初乳中IGF-I提取物能改善腸黏膜的損傷，對腸黏膜的損傷有修復作用。

2.2 血漿D-乳酸水平

從本實驗結果看，MTX模型組血漿中D-乳酸水平明顯高于對照組，差異有顯著性（P＜0.05）。牛初乳IGF-I提取物組和IGF-I組明顯低于MTX模型組（P＜0.05）。牛初乳IGF-I提取物組同IGF-I組沒有顯著差異（P＞0.05）（見圖2）。說明牛初乳中IGF-I提取物能降低腸黏膜的通透性。

圖1 牛初乳IGF-I提取物對血漿DAO活性的影響

圖2 牛初乳IGF-I提取物對血漿D-乳酸水平的影響

2.3 腸黏膜組織形態學觀察

圖3 大鼠腸道組織學變化（HE，×200）

由圖3光鏡檢查發現，對照組腸黏膜細胞排列基本整齊，結構完整，無組織壞死、缺失及水腫。MTX模型組出現部分腸絨毛脫落、炎細胞浸潤。牛初乳IGFI提取物組和IGF-I組病理損傷較MTX模型組明顯減輕，黏膜缺失少見，小部分腺體不完整，炎癥細胞浸潤少。各組小腸損傷程度積分比較見圖4。

圖4 小腸黏膜病理評分

3 討論

氨甲喋呤（methotrexate，MTX）為經典的抗葉酸類抗腫瘤藥，在殺死生長、增殖快速腫瘤細胞的同時，對正常組織細胞，尤其對胃腸道黏膜細胞有損傷，可直接抑制腸上皮細胞DNA的合成[9]。通過MTX誘導的鼠小腸炎模型的研究，發現MTX不利于腸上皮的更新，直接抑制腸上皮的更新，直接抑制腸上皮細胞DNA的合成。導致腸隱窩細胞有絲分裂減弱和腸絨毛縮短，直至腸隱窩形態喪失、絨毛皺縮脫落[10]。本文實驗結果表明，SD大鼠注射MTX后，大鼠糞便變稀，體重下降；大鼠黏膜廣泛缺失，腸微毛萎縮，間隙變寬，斷裂，凌亂，杯狀細胞缺失；腸上皮細胞核受損，核膜破壞，消失，線粒體腫脹；腸絨毛間質大量炎細胞浸潤和消腫，呈典型腸黏膜炎癥反應。

IGF-I在牛初乳中大量存在，是牛初乳中最重要的促生長因子。IGF-I可以明顯減輕化學藥物或缺血再灌注等原因所致的腸黏膜細胞的過度凋亡而對腸黏膜具有保護效應[11]。本實驗結果顯示，牛初乳IGFI提取物修復組和IGF-I修復組均可顯著改善腸黏膜充血、水腫糜爛等現象，降低大鼠腸黏膜損傷程度。

DAO是腸黏膜細胞的標志酶，約95%存在于哺乳動物小腸絨毛上層，是小腸黏膜上皮細胞內高活性的結構酶。在其他組織中則含量少、活性低[12]。生理狀況下血漿中DAO活性很低，在腸黏膜受損時，由腸黏膜細胞釋放的DAO大量入血，使血中濃度大幅上升。因此，血漿DAO活性是反映腸黏膜結構完整性較理想的指標。實驗結果顯示，大鼠注射MTX傷后6d仍明顯高于傷前。牛初乳IGF-I提取物修復組及IGFI修復組大鼠DAO活性均明顯低于MTX模型組，說明牛初乳IGF-I提取物修復組和IGF-I修復組對大鼠的腸黏膜損傷具有明顯的修復效果。

D-乳酸是腸道內細菌發酵產生的一種物質，哺乳動物組織不產生D-乳酸，且缺乏代謝該物質的酶系統，不能代謝該物質。在腸黏膜屏障正常時，血漿D-乳酸極低，只有當腸黏膜屏障受破壞時，D-乳酸透過腸過腸黏膜屏障入血，使血漿D-乳酸快速升高。因此，血漿D-乳酸水平可間接反映腸黏膜屏障功能，可作為腸道黏膜損傷指標之一。本結果顯示，大鼠注射MTX傷后6d仍明顯高于傷前。牛初乳IGF-I提取物修復組及IGF-I修復組大鼠D-乳酸水平均明顯低于MTX模型組，說明牛初乳IGF-I提取物修復組和IGFI修復組能降低腸黏膜的通透性，對大鼠的腸黏膜屏障損傷具有明顯的修復效果。

總之，使用牛初乳中IGF-I提取物能夠明顯減輕大鼠小腸組織的損傷，同時可減輕炎細胞的浸潤，對實驗性大鼠小腸炎具有修復作用。

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Effect of bovine colostrum IGF-I extraction on the recovery of intestinal mucositis

LV Jian-guang,SONG Wei,HUO Gui-cheng*
（Key Lab of Dairy Science,Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China）

Objective:To study the effect of bovine colostrum insulin-like growth factor-I(IGF-I)extraction on injury of the intestine in rat.Methods:Rat model of enteritis was induced by Methotrexate (MTX).The experimental animals were randomly divided into four groups:normal group，MTX model group (20μg/kg)，bovine colostrum IGF-I extraction recovery group (75μg/kg)and IGF-I recovery group (75μg/kg).The last two groups were administered in corresponding groups by gastric irrigation daily for 5 days，and the administered time had been from 2nd day to 5th day.Plasma diamine oxidase (DAO)and D-lactate level were measured，histological changes in intestinal tissue were observed under the light microscope.Results:Compared with normal group，the activity of DAO and D-lactate level were significantly increased (P＜0.05)，intestine injury was deeper than the normal group(P＜0.05).The bovine colostrum IGF-I extraction recovery group and the IGF-I recovery group could less the activity of DAO and D-lactate level(P＜0.05)，and could abate intestine injury obviously (P＜0.05). Conclusion:Bovine colostrum IGF-I extraction might reduce the damage of intestinal mucosa in rats，alleviate the infiltration of inflammatory cells，and has beneficial effect on rat enteritis.

bovine colostrum；insulin-like growth factors；intestinal mucosa/injuries

TS252.1

A

1002-0306（2011）10-0181-03

胃腸黏膜損傷在臨床上常見，嚴重的黏膜損傷不僅有大出血的潛在威脅，而且還會介導腸源性感染，引發全身性的病理、生理及內臟功能紊亂。因此，如何減輕黏膜損傷，促進損傷后再修復越來越受到重視。研究發現，初乳中含有大量的生長促進因子，特別是表皮生長因子（EGF）和胰島素生長因子（IGF-I）。EGF對小腸有明顯的滋養作用，并可以提高血及組織中Gln的濃度，加強Gln的攝取，從而能夠有效促進黏膜損傷的修復[1]。IGF-I作為胃腸道的一種有效營養因子，能有效地促進細胞分裂，對黏膜損傷有較好的治療效果，能夠加速腸的修復[2]。胃腸黏膜損傷后，可以引起內臟器官功能和組織病理學的改變，血漿中二胺氧化酶（DAO）活性及血漿D-乳酸水平升高[3]。本文主要研究了初乳中IGF-I作為一種營養因子，其提取物對氨甲喋呤（MTX）引起大鼠腸黏膜炎后的修復效果。

2010-12-07 *通訊聯系人

呂劍光（1984-），男，碩士研究生，研究方向：乳品科學與工程。

東北農業大學生物乳制品理論與技術創新團隊項目（CXT007）。