乳酸菌中抗李斯特細菌素的篩選及理化性質(zhì)分析

張紅星，劉 麗，劉 慧，謝遠紅，陳湘寧

（北京農(nóng)學院食品科學系，北京102206）

乳酸菌中抗李斯特細菌素的篩選及理化性質(zhì)分析

張紅星，劉 麗，劉 慧，謝遠紅，陳湘寧*

（北京農(nóng)學院食品科學系，北京102206）

從魚肉丸中分離篩選到1株具有抑菌活性的乳酸菌菌株Y153，對單核細胞增生李斯特菌ATCC54003的生長具有良好的抑制作用。16S rRNA序列同源性分析鑒定乳酸菌Y153為乳酸鏈球菌屬（Streptococcus）。在排除有機酸、過氧化氫的干擾后，確定該抑菌物質(zhì)為蛋白類物質(zhì)，即細菌素，命名為細菌素Y153。理化性質(zhì)分析表明，細菌素Y153具有較好的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性可被人體內(nèi)蛋白酶降解的特性。由此對乳酸鏈球菌所產(chǎn)細菌素Y153有了初步的研究，為開發(fā)天然的食品防腐劑奠定理論基礎(chǔ)。

乳酸菌，抗李斯特，細菌素，理化性質(zhì)

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

分離源 各類肉制品（魚肉丸、牦牛干、魚干、臘腸等）；指示菌菌株 單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）ATCC54003，為中國農(nóng)業(yè)大學食品學院406實驗室保藏菌種；乳酸菌分離培養(yǎng)基 胰蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母浸粉5.0g、檸檬酸三銨2.0g、葡萄糖20.0g、吐溫80 1.0mL、乙酸鈉5.0g、磷酸氫二鉀2.0g、硫酸鎂0.5g、硫酸錳0.25g、瓊脂15.0g、水1L，pH6.5，121℃滅菌20min，當MRS培養(yǎng)基冷卻至45～50℃時，加入適量已滅菌的碳酸鈣粉末,充分混勻,倒平板；改良的MRS培養(yǎng)基 胰蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母浸粉5.0g、檸檬酸三銨2.0g、葡萄糖20.0g、吐溫80 1.0mL、乙酸鈉5.0g、磷酸氫二鉀2.0g、硫酸鎂0.5g、硫酸錳0.25g、瓊脂15.0g、水1L，pH6.5；單核細胞增生李斯特氏菌培養(yǎng)基 胰蛋白胨17.0g、大豆胨3.0g、酵母浸粉6.0g、氯化鈉5.0g、磷酸氫二鉀2.5g、葡萄糖2.5g、水1L，固體培養(yǎng)基則加入1.5%的瓊脂，pH6.5；培養(yǎng)基中使用的藥品 均為國產(chǎn)分析純；細菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒 北京全式金生物技術(shù)有限公司；16S rRNA的PCR擴增引物 由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，鑒定乳酸菌的引物：上游引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游引物：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。鑒定乳酸菌所產(chǎn)細菌素的引物：上游引物：5′-CAAGATCGTTAACCAGTTT-3′；下游引物：5′-CCGTTGTTCCCATAGTCTAA-3′。

UV-1800型紫外分光光度計 日本；PHS-3B便攜式酸度計 雷磁；5417R臺式高速冷凍離心機Thermo；MLS-3750全自動高壓滅菌鍋 SANYO；DL-CY-1N型超級潔凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾；WS-01恒溫恒濕培養(yǎng)箱 湖北黃石恒豐；梯度PCR儀C1000 BIO-RAD。

1.2 實驗方法

1.2.1 肉制品中乳酸菌的分離 將肉制品研磨后，用無菌生理鹽水進行梯度稀釋，涂布到乳酸菌分離培養(yǎng)基上，37℃恒溫恒濕箱培養(yǎng)，挑選有溶鈣圈的菌落，在MRS培養(yǎng)基上多次劃線純化，挑取單菌落，接種斜面，培養(yǎng)24～36h，4℃保藏備用。

1.2.2 指示菌的培養(yǎng) 將單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）ATCC54003接種于液體培養(yǎng)基中，于搖床上振蕩培養(yǎng)過夜，4℃保藏備用。

1.2.3 抑菌乳酸菌的初篩 將乳酸菌活化培養(yǎng)后，以1%接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)到穩(wěn)定期，12000r/min，4℃離心10min，收集上清液，用1mol/L NaOH調(diào)pH值至6.0，以排除有機酸的干擾[6-7]。4℃保藏備用。

抑菌實驗采用牛津杯法[8]：先將指示菌稀釋至107cfu/ mL，與加熱融化的固體培養(yǎng)基混勻后，傾注約15mL于平皿中，待其凝固后，輕輕放上牛津杯，取100μL上清液加入牛津杯。4℃冰箱擴散4h后，置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)12h，觀察抑菌圈的出現(xiàn)。

1.2.4 產(chǎn)細菌素乳酸菌的復篩 分別用過氧化氫酶、鏈霉蛋白酶E、胰蛋白酶和蛋白酶K在各自作用的最適pH值下處理發(fā)酵上清液，各酶的終濃度是1mg/mL，37℃水浴2h后，再調(diào)回pH6.0，采用牛津杯法做抑菌實驗，對照為未做處理的pH6.0的發(fā)酵上清液。

1.2.5 產(chǎn)細菌素乳酸菌的16SrRNA序列同源性分析鑒定 乳酸菌基因組DNA的提取使用天根生化公司的細菌基因組提取試劑盒。PCR擴增的引物分別為上游引物（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和下游引物（5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）。PCR反應體系（50μL）：DNA模板1μL，dNTP 4μL，10×PCR buffer 5μL，上下游引物各1μL，Taq酶1μL，ddH2O 37μL。PCR擴增條件：95℃預變性5min，94℃變性1min，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。PCR純化產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)有限公司純化測序。得到的PCR產(chǎn)物序列通過BLAST在基因庫中進行同源性比較，并將其鑒定到種。

1.2.6 熱穩(wěn)定性實驗 將發(fā)酵上清液調(diào)pH至6.0，分別做如下處理：60℃10min，60℃30min，60℃90min，100℃10min，100℃30min，100℃90min，121℃15min，做抑菌實驗。

1.2.7 酸堿穩(wěn)定性實驗 將發(fā)酵上清液分別調(diào)pH至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0，37℃處理2h，再調(diào)回pH為6.0，做抑菌實驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉制品中乳酸菌的分離

采用微生物學方法，從各類肉制品（魚肉丸、牛肉丸、羊雜、魚干、臘腸）中分離乳酸菌5株，形態(tài)學觀察其中包括球菌3株 （分離自魚肉丸、牛肉丸和臘腸）和桿菌2株（分離自羊雜）。

2.2 抑菌乳酸菌的初篩

采用牛津杯法，從5株乳酸菌中初步篩選到1株（分離自魚肉丸）對指示菌生長有抑制作用的乳酸菌，抑菌圈直徑達到14.0mm，將其命名為Y153。觀察Y153的菌落形態(tài)：菌落呈乳白色、圓形、突起，邊緣圓滑。歸類于革蘭氏陽性的乳酸球菌。

2.3 產(chǎn)細菌素乳酸菌的復篩

圖1 抑菌物質(zhì)對蛋白酶的敏感性

發(fā)酵上清液用鏈霉蛋白酶E、胰蛋白酶和蛋白酶K處理后抑菌圈完全消失，表明這種抑菌物質(zhì)可以被人體內(nèi)的蛋白酶所降解，不會在人體內(nèi)殘留，見圖1。用過氧化氫酶處理的發(fā)酵上清液和未做處理上清液的抑菌圈大小基本一致，為14.0mm，表明發(fā)酵上清液中存在的抑菌物質(zhì)是細菌素，而非過氧化氫。將菌株Y153代謝過程中產(chǎn)生的細菌素命名為細菌素Y153。ɑ-淀粉酶處理后發(fā)酵上清液的抑菌圈縮小而且抑菌圈由對照中透亮的狀態(tài)變得很模糊，說明細菌素Y153的抑菌活性依賴于糖基化修飾[9]。

2.4 菌株Y153的16S rRNA序列同源性分析鑒定結(jié)果

以菌株Y153基因組DNA為模板，采用16S rRNA引物進行PCR擴增，得到約1500bp的特異性擴增產(chǎn)物，見圖2。將測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站中應用BLAST軟件在基因庫中進行同源性搜索，結(jié)果如圖3所示。Y153的16S rRNA PCR擴增產(chǎn)物與Streptococcus macedonicus strain ChF-II-str93（No.HM462406）的基因序列同源性達到99.67%，根據(jù)以上情況得出，Y153為乳酸鏈球菌屬（Streptococcus）。

圖2 Y153的16SrRNA PCR產(chǎn)物電泳圖注：M-DNA Marker DL2000；1-陰性對照；2-16S rRNA PCR擴增產(chǎn)物。

圖3 Y153的16SrRNAPCR擴增產(chǎn)物與Streptococcusmacedonicus ChF-II-str93（No.HM462406）的基因序列同源性比較

2.5 熱穩(wěn)定性實驗

將乳酸鏈球菌Y153的發(fā)酵上清液調(diào)pH至6.0后，用不同的溫度處理不同的時間后做抑菌實驗，結(jié)果見圖4，細菌素經(jīng)100℃處理30min后，抑菌圈大小與對照基本相同，為14.5mm。100℃處理90min抑菌圈略有縮小，抑菌直徑為11.0mm，表明此細菌素熱穩(wěn)定性較好。

圖4 細菌素Y153的熱穩(wěn)定性

2.6 酸堿穩(wěn)定性實驗

將乳酸鏈球菌Y153的發(fā)酵上清液調(diào)至不同的pH處理后，做抑菌實驗，結(jié)果見圖5，細菌素在pH2～10的范圍內(nèi)抑菌效果很穩(wěn)定，表明此細菌素具有較好的酸堿穩(wěn)定性。

圖5 細菌素Y153的酸堿穩(wěn)定性注：1-pH 2.0；2-pH 4.0；3-pH 6.0；4-pH 8.0；5-pH 10.0；6-pH 12.0。

3 結(jié)論

魚肉丸中篩選的乳酸鏈球菌所產(chǎn)細菌素Y153具有較好的熱穩(wěn)定性、pH2～10范圍內(nèi)有極強的抑菌活性且不在人體內(nèi)殘留。但是乳酸鏈球菌屬中有些菌是存在于人體口腔和腸道的正常菌群，有些是人和溫血動物的致病菌。細菌素應用于食品防腐有兩種方式：一種是直接添加細菌素生產(chǎn)菌株，其前提條件是細菌素產(chǎn)生菌是益生菌，不會對人體造成傷害；另一種方式是添加細菌素純品，這就需要采用純化方法來提取、純化細菌素。乳酸鏈球菌Y153是否對人體有害，需要進一步研究加以確定。

根據(jù)細菌素結(jié)構(gòu)、相對分子量、熱穩(wěn)定性以及抑菌譜等特性，目前可將乳酸菌細菌素的主要細菌素純品，分為三大類[10]：Ⅰ類是羊毛硫細菌素，分子內(nèi)硫醚環(huán)中含有稀有氨基酸修飾后的小肽（小于5ku）；Ⅱ類細菌素是不含羊毛硫氨酸、小的熱穩(wěn)定性多肽（小于10ku）；Ⅲ類細菌素是大的熱不穩(wěn)定的蛋白（30ku以上）。Tricine-SDS-PAGE電泳可以確定細菌素的分子量，從而對細菌素的分類情況加以判斷，課題組目前正在進行。

本研究從魚肉丸中篩選到一株對單核細胞增生李斯特菌有抑菌活性的乳酸鏈球菌菌株Y153，對所產(chǎn)細菌素的理化特性進行了初步的研究，旨在為該細菌素在食品保鮮防腐中的應用提供理論依據(jù)。

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Screening of anti-Listeria bacteriocin of lactic acid bacteria and its physicochemical characteristics

ZHANG Hong-xing，LIU Li，LIU Hui，XIE Yuan-hong，CHEN Xiang-ning*
（Department of Food Science，Beijing University of Agriculture，Beijing 102206，China）

Strain Y153，isolated from fish balls，produced antimicrobial substance which was inhibitory to Listeria monocytogenes 54003.Strain Y153 was identified as Streptococcus by using 16S rRNA gene sequence homology analysis.After eliminating the effect of organic acid and hydrogen peroxide，the antimicrobial substance with its proteinaceous nature was confirmed as bacteriocin.Bacteriocin Y153 was heat-stable and remained activity after incubation at a wide pH.It could be degraded by proteases existing in the human body. A preliminary study on the bacteriocin producted by Streptococcus strain Y153 had been made to lay the basis for the development of natural food preservative.

Lactic acid bacteria；anti-Listeria；bacteriocin；physicochemical characteristics

TS201.1

A

1002-0306（2011）10-0231-04

乳酸菌是指發(fā)酵糖類、主要產(chǎn)物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細菌的總稱。大多數(shù)不運動，少數(shù)以周毛運動。菌體常排列成鏈。在其發(fā)酵產(chǎn)物中只有乳酸的稱為同型乳酸發(fā)酵，而產(chǎn)物中除乳酸外還有較多乙酸、乙醇、CO2等物質(zhì)的稱為異型乳酸發(fā)酵。有微好氧菌和專性厭氧菌。根據(jù)細胞為球狀或桿狀，可分為兩大類，即乳酸鏈球菌族（Streptococceae）和乳酸桿菌族（Lactobacilleae）。其中，乳酸鏈球菌族，菌體球狀，通常成對或成鏈，在固體培養(yǎng)基上菌落較小，生長緩慢。多數(shù)為同型發(fā)酵，如鏈球菌屬（Streptococcus），是與人類關(guān)系密切的重要菌群，有些菌是人和溫血動物的致病菌；有些是人體的正常菌群存在于口腔和腸道；有些是乳制品及植物發(fā)酵食品中的常用菌，常在食品工業(yè)中使用，如乳鏈球菌（S.lactis）。少數(shù)為異型發(fā)酵，如腸膜狀明串珠菌（Leuconostocmesenteroides）是制藥工業(yè)上生產(chǎn)右旋糖酐的重要菌種，但也是制糖工業(yè)的一種有害菌，常使糖汁發(fā)粘稠而無法加工[1-2]。細菌素是乳酸菌代謝過程中通過核糖體合成機制產(chǎn)生的一類具有抑菌活性的多肽或蛋白質(zhì)類物質(zhì)，抑菌對象主要是近緣菌株，而某些細菌素如nisin則具有廣譜性的抑菌能力[3-4]。目前，將細菌素作為防腐劑應用到食品中有如下報道：nisin能很好地抑制肉毒梭狀芽孢桿菌的生長；乳桿菌素sakacin能抑制單核細胞增生的李斯特菌；明串珠菌細菌素對李斯特菌、乳球菌、糞腸球菌都有抑制作用；片球菌屬產(chǎn)生的細菌素對產(chǎn)氣莢膜梭菌、單核細胞增生李斯特菌和金黃色葡萄球菌等G+菌以及惡臭假單孢菌、嗜水氣單孢菌都具有抑制作用等[5]。課題組從魚肉丸中篩選到了1株對單核細胞增生李斯特菌的生長有良好抑制作用的乳酸鏈球菌菌株Y153，并對所產(chǎn)細菌素在酶敏感性、熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性方面進行了研究，為開發(fā)天然的食品防腐劑奠定理論基礎(chǔ)。

2010-10-21 *通訊聯(lián)系人

張紅星（1970-），男，副教授，研究方向：食品生物技術(shù)與功能乳品。

北京市教委資助項目“農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程重點學科建設(shè)”（PXM2009_014207_078172）。