嗜熱真菌發酵產木聚糖酶培養基的優化及部分酶學性質的研究

張新峰，王偉平，汪 蓉，王琛琛，陽 飛，張華山，*

（1.發酵工程省部共建教育部重點實驗室，湖北工業大學，湖北武漢430068；2.湖北大學知行學院，湖北武漢430011）

嗜熱真菌發酵產木聚糖酶培養基的優化及部分酶學性質的研究

張新峰1，王偉平1，汪 蓉2，王琛琛1，陽 飛1，張華山1，*

（1.發酵工程省部共建教育部重點實驗室，湖北工業大學，湖北武漢430068；2.湖北大學知行學院，湖北武漢430011）

采用響應面法對嗜熱真菌發酵產木聚糖酶的培養基進行優化以及對該酶液的基本性質進行研究。首先對初始培養基中的8種影響因素進行Plackett-Burman設計，篩選出3種重要影響因素，即玉米芯、尿素和KH2PO4；再利用最陡爬坡實驗為中心組合實驗確定最大響應區間，最后經響應面分析獲得最優化結果：玉米芯濃度為4.570%（w/v），尿素濃度為1.797%（w/v），KH2PO4濃度為0.497%（w/v），酶活提高了18%。該酶對玉米芯為底物的專一性較好，最適酶促反應溫度為65℃且在該溫度下較穩定，最適反應pH為6.8，并且pH穩定性較好。

嗜熱真菌，木聚糖酶，優化，酶學性質

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嗜熱真菌T-U-03-10（Thermomyces lanuginosusT -U-03-10） 為湖北工業大學生工樓207實驗室保藏菌種；斜面活化培養基 PDA培養基；產酶基礎培養基 玉米芯3.0%，尿素2.0%，KH2PO40.5%，ZnSO40.2%，MgSO4·7H2O 0.03%，CaCl20.03%，FeSO4·7H2O 0.03%，吐溫-80 0.03%，pH6.5，于121℃滅菌30min；可溶性淀粉，羧甲基纖維素鈉，中華一號濾紙，pH6.5磷酸緩沖液，0.1mol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（pH4.0～8.0），0.05mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（pH9.0～10.0），DNS溶液[4]，其他藥品均為分析純。

DNP-9052型電熱恒溫培養箱 上海精宏實驗設備有限公司；THZ-82恒溫水浴振蕩器 常州諾基儀器有限公司；TGL-16C臺式離心機 上海安亭離心機；ZHWY-2102C恒溫搖床 上海智城分析儀制造有限公司；Delta320pH計 梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 搖瓶培養條件 將2cm2見方的平板培養基上生長2.5～3d的菌絲體接入裝有80mL產酶培養基的250mL三角瓶中，于50℃下，轉速180r/min振蕩培養7d。

1.2.2 培養基優化

1.2.2.1 Plackett-Burman設計篩選重要影響因素 實驗設計及數據分析均采用SAS-JMP軟件。在前期單因素優化的基礎上，采用N=12的PB實驗設計表，考察發酵培養基中的8個因數，分別為玉米芯（X1）、尿素（X2）、KH2PO4（X3）、（NH4）2SO4（X4）、MgSO4·7H2O（X5）、CaCl2（X6）、FeSO4·7H2O（X7）、吐溫-80（X8），每個因素取兩個水平，木聚糖酶活（Y）作為響應值。

1.2.2.2 最陡爬坡實驗設計 根據PB實驗結果分析得出顯著因素后，再依據各顯著因素的正負效應來確定最陡爬坡實驗的路徑（包括變化方向和步長），以便找出峰值，從而快速逼近最大響應區域。

1.2.2.3 Box-Behnken實驗設計 根據PB實驗和爬坡實驗結果進行Box-Behnken實驗設計研究，實驗結果仍然采用SAS-JMP軟件進行分析。

1.2.2.4 酶活的測定 取適量的發酵液經高速離心（8000r/min，5min），取上清液即為所得粗酶液，進行適當稀釋后測定酶活力[5]。

1.2.3 木聚糖酶粗酶液酶學性質的研究

1.2.3.1 粗酶液的制備 采用優化后的發酵工藝條件制備產酶發酵液，然后在6000r/min下離心5min，取上清液即為粗酶液。

1.2.3.2 不同底物對酶活的影響[6]將0.500g木聚糖、0.500g羧甲基纖維素鈉、0.500g可溶性淀粉分別用100mL 0.1mol/L pH6.8檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液配制為0.5%的底物溶液，長寬比為2×1cm濾紙也加入上述緩沖液，再分別加入稀釋好的酶液反應，測定酶活。以木聚糖為底物測得酶活定義為100%，其他底物測得酶活均換算為相對酶活。

1.2.3.3 最適酶促反應溫度的確定 將0.5%木聚糖溶液分別在45、50、55、60、65、70、75℃下預熱2min，然后加入一定量稀釋好的粗酶液在相應的溫度下測定酶活。測定三次求平均值，將最高的酶活力定義為100%，分別計算不同溫度下木聚糖酶的相對酶活力。1.2.3.4 酶的熱穩定性實驗 將稀釋后的酶液分別置于55、60、65、70℃保溫不同的時間后，立即冷卻，然后于60℃下測定酶活力，測定三次求平均值，未經保溫處理測得酶活力定義為100%，分別計算溫浴不同時間后的殘余酶活。

1.2.3.5 最適酶促反應pH的確定 分別采用0.1mol/L（pH4.0～8.0）檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液和0.05mol/L（pH9.0～10.0）甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液配制0.5%木聚糖作為底物，與稀釋后酶液反應，測定酶活。測定三次求均值，將最高的酶活定義為100%，分別計算不同pH條件下酶的相對酶活力。

1.2.3.6 最適pH酶的穩定性實驗 將粗酶液添加到最適pH緩沖液中，室溫下保持不同時間（0、1、2、3h、4、5、6h），測定酶活。測定三次求均值，將0h酶活定義為100%，分別計算保持不同時間的相對酶活力。

2 結果與分析

2.1 培養基優化

2.1.1 Plackett-Burman實驗設計優化 用SAS-JMP軟件設計的Plackett-Burman實驗安排及結果見表1，實驗回歸分析見表2。由表2結果分析可知，培養基的顯著因素依次為尿素、KH2PO4、玉米芯，它們的可信度均大于90%。其中，玉米芯、KH2PO4濃度對產酶為正效應，而尿素濃度對產酶為負效應。為了提高產酶量，應逐步提高玉米芯、KH2PO4濃度和降低尿素濃度。其他因素對產酶影響不大，為此濃度不變。

表1 Plackett-Burman實驗設計及結果

表2 Plackett-Burman實驗設計回歸分析結果

2.1.2 中心實驗點的確定 由表3可知，隨著尿素、KH2PO4、玉米芯的變化，酶活先上升后下降。當玉米芯濃度為4.5%，尿素濃度為1.8%，KH2PO4為0.5%時，酶活達到最大，即以此為實驗優化中心點，進行下一步實驗。

表3 最陡爬坡實驗設計及其結果

2.1.3 Box-Behnken實驗設計優化 以玉米芯、尿素和KH2PO4為顯著因素，因素水平如表4所示，Box-Behnken實驗設計及結果如表5所示。

表4 Box-behnken設計因素水平表

表5 Box-behnken實驗設計及結果

應用SAS-JMP軟件對表5實驗結果進行最小二乘擬合，得到模型如下：

圖1 實際值對預測值的模型擬合圖

表6 回歸方程的方差分析

由圖1實際值對預測值的模型擬合和表6回歸方程的方差分析可知，P=0.0011＜α=0.05，則該模型顯著，模型擬合度R2=0.98，說明該模型在一定程度上反映響應值的變化，擬合度較高。失擬合不顯著（P= 0.2074）則表明誤差是由不可避免的隨機誤差引起的。

用JMP繪制三維立體響應曲面圖，見圖2。

圖2 各因素對木聚糖酶活影響的響應面圖

通過SAS-JMP軟件對圖2分析得出，當X1= 0.0467182，X2=-0.078431，X3=-0.030674，即玉米芯濃度為4.570%，尿素濃度為1.797%，KH2PO4濃度為0.497%時，響應值Y達到最大，即木聚糖酶活為1645.29U/mL。

2.1.4 驗證實驗 為了準確地檢驗模型預測的可靠性，在培養基最佳優化條件下，進行5組平行發酵實驗，所測得酶活分別為1640.10、1642.60、1645.84、1646.71、1644.68U/mL，平均酶活力為1643.99U/mL，與模型預測值基本一致，表明該模型能很好地預測實際發酵產酶情況，并且與優化前的酶活1393.0U/mL相比提高了18.0%。

2.2 酶學性質的研究

2.2.1 不同底物對酶活的影響 添加不同底物對酶活的影響結果如表7所示。

表7 木聚糖酶的底物專一性

由表7可見，該木聚糖酶對羧甲基纖維素鈉和濾紙的酶活性很低，甚至對可溶性淀粉沒有酶活性，說明該突變菌株產的木聚糖酶對底物的專一性較好，有利于應用半纖維素降解。

2.2.2 最適酶促反應溫度的確定 該酶分別在不同溫度下測得酶活，結果如圖3所示。

圖3 溫度對酶促反應的影響

由圖3可見，酶活隨溫度的變化趨勢為先升高后降低。在55℃以下及70℃以上酶活力變化幅度較大，如在45℃和75℃時，酶活力水平分別降到30.06%和44.80%；當溫度在60～70℃時，酶活變化幅度較小，且均保持在85%以上。為此，確定最適酶促反應溫度為65℃。

2.2.3 酶的熱穩定性實驗 將木聚糖酶和底物的混合物分別在55、60、65、70℃溫浴60min，每隔10min測一次酶活，結果見圖4。

如圖4所示，在55～65℃條件下，保溫時間對該酶活的影響不明顯，保溫40min后剩余酶活力均在80%以上，不過，酶活力隨時間延長均有緩慢降低的趨勢。但當溫度達到70℃以上時，酶活隨時間下降的幅度較大。說明該酶適合在65℃下進行酶解反應，更有利于應用于制漿漂白工藝和半纖維素降解工業中。

圖4 酶的熱穩定性

2.2.4 最適酶促反應pH的確定 采用不同pH的緩沖液來配制酶解反應體系，結果見圖5。

圖5 pH對酶促反應的影響

圖5的結果表明，T-U-03-10所產木聚糖酶的pH作用范圍較寬，在pH5.0～8.0范圍內酶活均大于70%，不過最適酶促反應溫度在pH6.8左右，說明該酶較適合在中性條件下進行反應。但在堿性條件下，酶極易失活，說明該酶的耐堿性差而耐酸性較好，比較適合半纖維素降解環境。

圖6 處理時間對酶活的影響

2.2.5 最適pH酶的穩定性實驗 將酶液與木聚糖置于pH為6.8檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖體系中處理不同時間，結果見圖6。

由圖6可見，該酶在pH為6.8時相當穩定，在保持4h后酶活仍有90%以上，且在6h后酶活還有85.20%。說明該酶在最適pH下穩定性較好，有利于為后續的半纖維素酶解反應提供酸堿的穩定性。

3 討論

應用微生物發酵產木聚糖酶水解植物半纖維素制備低聚糖[7-9]已被各大生產企業所采用，但由于存在酶活力不高導致菌種選擇范圍較窄，以及酶的專一性不強、水解溫度不高、反應速度慢等造成低聚糖的后續分離純化困難、生產周期長等不利因素，為此，本實驗從培養基優化著手來提高酶活，同時又對該酶學的部分性質進行了初步的探討。

本實驗是在前期實驗單因素優化的基礎上，對培養基中已確定的8種因素利用響應面法進一步優化，以便獲得最佳的優化結果，從而進一步提高酶活。最佳產酶培養基為：玉米芯濃度為4.570%，尿素濃度為1.797%，KH2PO4濃度為0.497%，ZnSO40.2%，MgSO4·7H2O 0.03%，CaCl20.03%，FeSO4·7H2O 0.03%，吐溫-80 0.03%，從而酶活由1393U/mL提高到1644 U/mL，優化后達到了比較好的效果。該菌產的木聚糖酶對底物的專一性較強，以玉米芯為底物最好；酶的最適反應溫度為65℃且穩定性較好；最適pH為6.8，pH穩定性較好，而其他一些性質包括金屬離子、有機溶劑對酶性質的影響以及動力學反應參數值Km和Vmax測定有待進一步摸索。因此，根據上述實驗結果，初步預測嗜熱真菌T-U-03-10液態發酵產的木聚糖酶，適合用于后續實驗低聚木糖的制備。

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Optimization of fermentation medium for thermophilic fungal xylanase and study on some enzymatic properties

ZHANG Xin-feng1,WANG Wei-ping1,WANG Rong2,WANG Chen-chen1,YANG Fei1,ZHANG Hua-shan1,*
（1.Key Laboratory of Fermentation Technology,Ministry of Education,Hubei University of Technology,Wuhan 430068，China；2.Zhixing College of Hubei University，Wuhan 430011，China）

Fermentation medium of thermophilic fungal for xylanase production was optimized by response surface method and the basic properties of the enzyme solution were studied.First，eight kinds of factors of the initial medium was adopted by the Plackett-Burman design，and selected three kinds of important factors，namely，corn cob，urea and KH2PO4，and then the path of steepest ascent was adopted for the central composite experiment to determine the maximum response interval.Finally response surface optimization results was obtained，corncob 4.570%(w/v)，urea 1.797%(w/v)，KH2PO40.497%(w/v)，therefore，enzyme activity was increased by 18%.The enzyme pecificity was better，corncob being regard as substrate，the optimal enzyme reaction temperature was 65℃ and the temperature was more stable，the optimum pH 6.8 and pH stability was better.

ThermophiIic fungi；xylanase；optimization；enzymatic properties

TS201.2

A

1002-0306（2011）10-0249-04

木聚糖酶是一種復合酶系，包括β-1，4-木聚糖酶和β-木糖苷酶[1]，專一用于木聚糖的降解。木聚糖酶對自然界中存在的大量半纖維素也起著重要的降解作用，該酶還廣泛應用于醫藥、食品、飼料添加劑等方面，已受到廣泛的關注[2]。由于該菌株產木聚糖酶活力不是很高，本實驗采用響應面法優化培養基來提高其產酶能力。響應面法[3]（response sur face methodology，RSM）是采用合理的實驗設計并通過實驗獲得一定數據，再用多元二次方程來擬合因素和響應值之間的函數關系，最后對回歸方程的分析來尋求最佳優化工藝，從而解決多變量問題的一種統計學方法。為了更好地應用該酶來降解半纖維素制備低聚木糖，對酶的部分性質做了初步的研究，以便于找到最適的水解條件。

2010-09-17 *通訊聯系人

張新峰（1983-），男，在讀研究生，研究方向：發酵工程。