苯酚-硫酸法測定海灣扇貝多糖方法的研究

佟海菊，張志勝，孫克巖，劉亞南

（河北農業大學食品科技學院，河北保定071001）

苯酚-硫酸法測定海灣扇貝多糖方法的研究

佟海菊，張志勝*，孫克巖，劉亞南

（河北農業大學食品科技學院，河北保定071001）

以葡萄糖為標準品，優化苯酚-硫酸法測定海灣扇貝多糖含量的條件，并對該法的精密度、加標回收率等進行了研究，得出最佳顯色條件為：苯酚用量1.0mL，濃硫酸用量5.0mL，室溫放置30min，在480nm處測定吸光度。結果表明，此方法是測定海灣扇貝多糖含量的一種穩定性好、回收率高的簡便方法。

苯酚-硫酸法，海灣扇貝多糖，含量測定

1 材料與方法

1.1 材料與設備

海灣扇貝粗多糖 本實驗室制得；濃硫酸、重蒸苯酚、無水乙醇、葡萄糖 均為分析純；6%苯酚溶液精密稱取重蒸苯酚3.0g，置50mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻后，置棕色試劑瓶中，冰箱中冷藏儲存備用；葡萄糖標準溶液 精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖10mg于250mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻；海灣扇貝多糖溶液 精密稱取海灣扇貝粗多糖，配制成一定濃度的海灣扇貝多糖溶液。

UV-2800型紫外可見分光光度計 上海尤尼科儀器有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋 金壇市杰瑞爾電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 最大吸收波長的選擇 分別吸取海灣扇貝多糖溶液和葡萄糖標準溶液各1mL，以蒸餾水為空白，按照標準曲線制備方法顯色后，采用UV-2800紫外可見分光光度計進行掃描，波長范圍為400～600nm，確定其最大吸收峰所對應的波長。

1.2.2 濃硫酸用量實驗 吸取1mL海灣扇貝多糖溶液，置于具塞玻璃試管中，加水補足至2mL，加入6%苯酚溶液1mL，搖勻后分別迅速滴加濃硫酸4.0、4.5、5.0、5.5、6.0mL，室溫放置30min，于1.2.1確定的波長測吸光度。

1.2.3 苯酚用量實驗 吸取1mL海灣扇貝多糖溶液，置于具塞玻璃試管中，加水補足至2mL，分別加入6%苯酚溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL，搖勻后迅速滴加由1.2.2確定的濃硫酸，室溫放置30min，于1.2.1確定的波長測定吸光度。

1.2.4 顯色溫度的選擇 吸取1mL海灣扇貝多糖溶液，置于具塞玻璃試管中，加水補足至2mL，加入由1.2.2和1.2.3確定的苯酚和濃硫酸，搖勻后分別在室溫、40、60、80℃條件下放置30min，于1.2.1確定的波長測定吸光度。

1.2.5 顯色時間的選擇 吸取1mL海灣扇貝多糖溶液，置于具塞玻璃試管中，加水補足至2mL，加入由1.2.2和1.2.3確定的苯酚和濃硫酸，搖勻后在1.2.4確定的溫度下放置20、30、40、50、60min，于1.2.1確定的波長測定吸光度。

1.2.6 標準曲線的繪制[5]精密吸取葡萄糖標準溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL置于具塞玻璃試管中，加水補足至2mL，搖勻，依據1.2.1～1.2.5確定的測定條件，以2mL蒸餾水取代葡萄糖標準溶液顯色后作為空白，測定吸光度。

1.2.7 精密度實驗 精密吸取海灣扇貝多糖溶液1mL，按照標準曲線制備方法測定吸光度，平行測定5次。

1.2.8 穩定性實驗 精密吸取海灣扇貝多糖溶液1mL，按照標準曲線制備方法測定吸光度，連續3h內考查其穩定性。

1.2.9 加樣回收率實驗[6]精密吸取海灣扇貝多糖溶液1mL五份，各加入葡萄糖標準溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL，按照標準曲線制備方法測定吸光度，計算回收率。

2 結果與分析

2.1 測定波長的選擇

葡萄糖標準溶液和海灣扇貝多糖溶液顯色后用UV-2800紫外可見分光光度計于400～600nm波長范圍內掃描，結果如圖1所示，由圖1可知，兩種溶液均在480nm處有最大吸收，所以選擇480nm為測定波長。

圖1 最佳測定波長的選擇

2.2 硫酸用量實驗

由圖2可知，吸光度隨著濃硫酸用量的增加不斷增大，當濃硫酸用量增加到5mL以上時吸光度趨于平緩，所以選擇5mL為最佳濃硫酸用量。濃硫酸加入方式和速度對吸光度有一定的影響，應迅速垂直液面加入足夠的濃硫酸。

圖2 不同硫酸用量的吸光度

2.3 苯酚用量實驗

由圖3可知，當苯酚用量為1.0mL時，吸光度達到最高，繼續增加苯酚用量會使吸光度值下降，所以選擇1.0mL為苯酚最佳用量。

圖3 不同苯酚用量的吸光度

2.4 顯色溫度的選擇

表1 不同顯色溫度下的吸光度

由表1可知，在不同溫度下吸光度的變化不大，可見濃硫酸與水發生水合作用時放出的熱量可以滿足顯色的要求，因此選擇室溫條件下顯色，室溫顯色還能免去加熱冷卻的環節，使操作更簡便。

2.5 顯色時間的選擇

表2 不同顯色時間下的吸光度的影響

由表2可知，在20～60min內顯色穩定，時間對吸光度的影響不大，但是20min時冷卻不夠完全，選擇30min為最佳顯色時間。

2.6 標準曲線的繪制

以葡萄糖濃度(μg/mL)為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制吸光度—葡萄糖濃度關系曲線，其線性回歸方程為y=0.0132x-0.0081，相關系數r2為0.9993。結果表明，葡萄糖在8～36μg/mL范圍內其濃度與吸光度線性關系良好，如圖4所示。

2.7 精密度實驗

海灣扇貝多糖溶液重復測定5次的RSD值為0.62%（n=5），表明儀器的精密度良好。

圖4 葡萄糖標準曲線

表3 精密度測定結果

2.8 穩定性實驗

由表4可知，海灣扇貝多糖溶液的RSD為1.22%，表明顯色液在3h內穩定性良好。

表4 穩定性實驗結果

2.9 加樣回收率實驗

由表5可知，該實驗方法的平均回收率為100.7%，RSD為1.72%，表明方法的準確率較高。

3 結論

苯酚-硫酸法測定海灣扇貝多糖含量的最佳波長為480nm。苯酚-硫酸法中，以葡萄糖為對照，顯色的最佳條件為：苯酚加入量為1.0mL，濃硫酸的加入量為5mL，顯色溫度為室溫，顯色時間為30min，多糖含量在8～36μg/mL內其濃度與吸光度線性關系良好。回歸方程為：y=0.0132x-0.0081，相關系數r2為0.9993。該實驗方法的平均回收率為100.7%，RSD為1.72%，顯色液在3h內穩定性良好，表明該方法是測定海灣扇貝多糖含量的一種穩定性好、回收率高的簡便方法。

表5 加樣回收率實驗結果

[1]劉婷，周光明.多糖的提取和分析方法[J].化工時刊，2008，22（3）：66-70.

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[4]蘇穎，周選圍.改進苯酚-硫酸法快速測定蟲草多糖含量[J].食品研究與開發，2008，29（3）：31-34.

[5]劉敏，郭麗梅，張麗.苯酚-硫酸法測定油松花粉多糖含量研究[J].時珍國醫國藥，2010，21（6）：1526-1528.

[6]郭金龍，陳有君，孫國琴，等.苯酚-硫酸法測定杏鮑菇多糖方法的研究[J].食品科學，2008，29（12）：555-558.

Study on determination of polysaccharides content in argopectens irradias by phenol-sulfuric acid method

TONG Hai-ju,ZHANG Zhi-sheng*,SUN Ke-yan,LIU Ya-nan
（CollegeofFoodScienceandTechnology,AgriculturalUniversityofHebei,Baoding071001,China）

To optimize the condition of determining polysaccharides content by phenol-sulfuric acid method， using glucose as the standard sample.The precision and the recovery rate were studied，the better condition was as follows：1.0mL 6%solution of phenol，sulfuric acid 5.0mL，room-temperature for 30min，the absorbency rate was tested in wavelength 480nm.The result showed that the method can be used to determine the argopectens irradias polysaccharides simply and accurately.

phenol-sulfuric acid method；argopectens irradias polysaccharides；content determination

TS207.3

A

1002-0306（2011）10-0447-03

海灣扇貝屬軟體動物門，瓣鰓綱，異柱目，扇貝科，是我國重要的海洋貝類資源。海灣扇貝營養豐富，富含蛋白質、氨基酸、多糖、高度不飽和脂肪酸和微量元素，其中海灣扇貝多糖具有抗腫瘤、抗氧化、降血糖、降血脂等多種生物學活性功能，可被開發為理想的保健產品[1-3]。因此，海灣扇貝多糖含量測定方法的研究對于評價海灣扇貝多糖產品的質量具有重要的意義。目前，苯酚–硫酸法因其方法簡單、快速，無需多糖純品和高級儀器等優點而被廣泛用于測定多糖含量。其原理為多糖在濃硫酸的作用下水解成單糖分子，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后和苯酚生成橙黃色化合物，在波長480～490nm處和一定濃度范圍內，其吸光度與糖濃度呈線性關系。但苯酚–硫酸法存在平行測定波動性大，重復性差，不同的含糖物質測定條件不同等缺點[4]。苯酚–硫酸法測定海灣扇貝多糖含量的研究尚未見報道，本文以海灣扇貝多糖為原料，研究其顯色條件，并對該方法的精密度、回收率、穩定性進行考察，得出海灣扇貝多糖含量的最佳測定方法。

2010-11-11 *通訊聯系人

佟海菊（1984-），女，在讀碩士研究生，主要從事功能食品開發研究。

國家海洋公益性行業科研專項（200805046）。