美洲大蠊提取物CⅡ-3對大鼠急性酒精性肝損傷的保護作用

張旭強，何 旭，陳俊雅，胡文帥，彭 芳

（大理學院藥學與化學學院，云南大理 671000）

美洲大蠊提取物CⅡ-3對大鼠急性酒精性肝損傷的保護作用

張旭強，何 旭，陳俊雅，胡文帥，彭 芳*

（大理學院藥學與化學學院，云南大理 671000）

目的：研究美洲大蠊提取物CⅡ-3對大鼠急性酒精性肝損傷的保護作用。方法：采用56°紅星二鍋頭制備大鼠急性酒精性肝損傷模型。通過檢測大鼠血清中ALT、AST、TG水平和肝組織中GSH、SOD和MDA的水平，以及肝臟病理學檢查來觀察CⅡ-3的效果。結(jié)果：CⅡ-3能降低肝損傷大鼠血清中ALT、AST、TG的水平（P＜0.01），降低肝組織中MDA含量、提高SOD和GSH的活性（P＜0.01）；肝組織病理學觀察可見，CⅡ-3各劑量組與模型組相比，大鼠肝臟脂肪變性、炎癥壞死均有所減輕，高劑量組改善最為顯著。結(jié)論：CⅡ-3對大鼠急性酒精性肝損傷有明顯的保護作用。

美洲大蠊；酒精性肝損傷；保護作用

近年來，酒精濫用和酒精依賴引起的疾病，全球增加了3倍，已成為當今世界日益嚴重的公共衛(wèi)生問題〔1-2〕。眾所周知，短時間內(nèi)大量攝入酒精，可造成急性肝損傷，長期大量飲酒可引發(fā)酒精性肝病（Alcoholic liver disease，ALD），初期通常表現(xiàn)為脂肪肝，進而可發(fā)展成酒精性肝炎、酒精性肝硬化。隨著全球酒精消費量的快速上升，ALD的發(fā)病率也呈逐年上升的趨勢，酒精已成為我國繼病毒性肝炎后導致肝損害的第二大病因〔3〕。目前，對ALD的研究雖然取得了一些進展，但對其治療仍無令人滿意的藥物。從天然動、植物中尋找具有生物活性的保肝藥物，已成為國內(nèi)外科研工作者研究的熱點之一。

美洲大蠊（Periplaneta americana）屬昆蟲綱，蜚蠊目，蜚蠊科，俗稱蟑螂，性味咸、寒；具有破瘀化積、消腫、解毒、通利血脈之功效。自20世紀70年代以來，國內(nèi)學者對美洲大蠊的研究取得了很好的進展，先后開發(fā)了美洲大蠊系列昆蟲藥品，如康復新、心脈隆和肝龍等。隨著研究的不斷深入，有研究發(fā)現(xiàn)美洲大蠊提取物有抗菌〔4〕、抗腫瘤〔5〕活性。在肝損傷方面，近年研究表明，美洲大蠊提取物能抑制雛鴨體內(nèi)鴨乙型肝炎病毒的復制，對乙型肝炎的治療作用明顯〔6-7〕，而且對四氯化碳（CCl4）和刀豆蛋白A所致肝損傷有較好的保護作用〔8-9〕。但是，有關(guān)美洲大蠊對酒精性肝損傷作用的研究，未見報道。本實驗研究美洲大蠊另一個有效部位CⅡ-3對酒精性肝損傷的保護作用，為開發(fā)酒精性肝病的防治藥物，提供相關(guān)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康SD大鼠60只，雌雄各半，體重200±20 g，由昆明醫(yī)學院動物實驗中心提供，合格證號：SCXK（滇）2005-0008。

1.2 試劑與儀器 美洲大蠊提取物CⅡ-3由云南省大理學院藥學與化學學院劉光明教授提供（批號：20101223）；硫普羅寧為河南省新誼藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品（批號：100403）；56°紅星二鍋頭白酒為北京紅星股份有限公司產(chǎn)品（批號：20101102）；冰乙酸為天津市大茂化學試劑廠產(chǎn)品（批號：20080603）；無水乙醇為天津市風船化學試劑科技有限公司產(chǎn)品（批號：090214）；試劑盒：谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）測試盒（批號：20101013）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）測試盒（批號：20101013）、甘油三酯（TG）測試盒（批號：20101012）、超氧化物歧化酶（SOD）測試盒（批號：20101222）、丙二醛（MDA）測試盒（批號：20101008）、谷胱甘肽（GSH）測試盒（批號：20110322）、考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒（批號：20101222），以上試劑盒均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。

1.0 型高速低溫離心機（德國Heraeus），XW-80A型漩渦混合器（上海精科實業(yè)有限公司）；MERRLERAE240型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；JH-C-06-04型紫外分光光度計（上海青華科技儀器有限公司）；H.S21-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（北京長安科學儀器廠）。

1.3 實驗方法

1.3.1 造模與給藥 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機分為6組，每組10只，即正常對照組、模型對照組、硫普羅寧陽性對照組（100 mg/kg）、CⅡ-3低劑量組（25 mg/kg）、CⅡ-3中劑量組（50 mg/kg）、CⅡ-3高劑量組（100 mg/kg）。各組大鼠每日實驗開始前禁食不禁水6 h，各組大鼠均采用灌胃給藥，正常對照組和模型組給等量生理鹽水，各給藥組給予相應(yīng)藥物，1 h后除正常對照組外，其余各組灌胃56°二鍋頭白酒20 mL/kg，共10 d。

1.3.2 樣本采集與指標檢測 最后一天灌胃給酒后，禁食不禁水12 h，各組動物稱重，眼球取血，靜置1 h后，3 500 r/min離心15 min，分離血清備用。取血完畢后處死大鼠，立刻剖腹，摘取肝臟和脾臟并稱重，計算肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)。然后取肝左葉浸泡于10%福爾馬林中固定24 h，剩余肝臟分別制備成10%及1%肝臟勻漿備用。

1.3.3 檢測指標 血清用于檢測ALT、AST、TG水平；10%肝臟勻漿用于檢測MDA、GSH水平；1%肝臟勻漿用于檢測SOD水平；10%福爾馬林固定的肝組織經(jīng)脫水，石蠟包埋，切片后進行HE染色，光鏡下觀察肝組織病理改變。

2 結(jié)果

2.1 各實驗組動物一般狀態(tài)觀察 實驗期間，正常組大鼠精神充沛，活潑好動，毛發(fā)光澤，飲食及大便未見異常，體重明顯增加。模型組大鼠均有不同程度的精神萎靡，活動飲食減少，毛發(fā)不整，大便稀溏等表現(xiàn)。各給藥預防組大鼠精神狀態(tài)和飲食、大便等情況均較模型組有不同程度的改善，以CⅡ-3高劑量組和陽性對照組改善最為明顯。

2.2 CⅡ-3對酒精性肝損傷大鼠肝臟和脾臟指數(shù)的影響 模型組的大鼠肝臟指數(shù)明顯升高，與正常組比較有顯著性差異（P＜0.05）；與模型組比較，CⅡ-3三個劑量組均能降低大鼠肝臟指數(shù)及脾臟指數(shù)（P＜0.05），呈劑量相關(guān)性。結(jié)果見表1。

表1 CⅡ-3對酒精性肝損傷大鼠的肝臟及脾臟指數(shù)的影響（±s，n=10）

表1 CⅡ-3對酒精性肝損傷大鼠的肝臟及脾臟指數(shù)的影響（±s，n=10）

注：與正常對照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05

組別 給藥劑量（/mg/kg） 肝臟指數(shù)（/g/g）×100 脾臟指數(shù)（/g/g）×100正常對照組 — 3.20±0.18# 0.18±0.06#模型對照組 — 4.21±0.36* 0.34±0.12* CⅡ-3低劑量組 25 3.79±0.27*# 0.29±0.05*# CⅡ-3中劑量組 50 3.69±0.08*# 0.26±0.05*# CⅡ-3高劑量組 100 3.57±0.12*# 0.22±0.01*#硫普羅寧組 100 3.52±0.20*# 0.20±0.02*#

2.3 CⅡ-3對酒精性肝損傷大鼠血清中ALT、AST和TG水平的影響 模型組大鼠血清中ALT、AST和TG水平明顯升高，與正常組比較有顯著性差異（P＜0.01），提示造模成功；CⅡ-3三個劑量組均能顯著降低大鼠血清中ALT、AST和TG的水平，與模型組相比具有顯著性差異（P＜0.01），呈劑量相關(guān)性。結(jié)果見表2。

表2 CⅡ-3對酒精性肝損傷大鼠血清中AST、ALT和TG的影響（±s，n=10）

表2 CⅡ-3對酒精性肝損傷大鼠血清中AST、ALT和TG的影響（±s，n=10）

注：與正常對照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01

組別 給藥劑量（/mg/kg） ALT（/IU/L） AST（/IU/L） TG（/m mol/L）空白對照組 — 27.31±3.52## 41.58±7.40## 1.03±0.52##模型對照組 — 103.27±12.58** 120.40±18.15** 3.10±0.69** CⅡ-3低劑量組 25 79.28±9.49**## 91.88±10.76**## 2.34±0.45**# CⅡ-3中劑量組 50 62.71±10.89**## 77.90±8.86**## 1.66±0.44*## CⅡ-3高劑量組 100 32.12±4.10## 55.16±6.84*## 1.21±0.37*##硫普羅寧組 100 30.51±5.63## 47.99±4.65## 1.18±0.28##

2.4 CⅡ-3對酒精性肝損傷大鼠肝組織中SOD、GSH和MDA水平的影響 與模型組相比，CⅡ-3三個劑量組能明顯的降低組織中MDA的含量及升高組織中SOD和GSH的水平（P＜0.01），并呈劑量相關(guān)性。結(jié)果見表3。

表3 CⅡ-3對酒精性肝損傷大鼠肝組織中SOD、MDA和GSH的影響（±s，n=10）

表3 CⅡ-3對酒精性肝損傷大鼠肝組織中SOD、MDA和GSH的影響（±s，n=10）

注：與正常對照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01

組別 給藥劑量（/mg/kg） MDA（/nmol/mgprot） SOD（/U/mgprot） GSH（/mg/gprot）空白對照組 — 3.13±0.35## 216.15±19.34## 5.18±0.0.67##模型對照組 — 8.66±0.73** 125.06±8.32** 1.86±0.24** CⅡ-3低劑量 25 6.81±0.90**## 152.48±13.34**# 2.62±0.31**# CⅡ-3中劑量 50 5.73±0.62**## 173.69±7.47**## 3.79±0.67**## CⅡ-3高劑量 100 3.76±0.76*## 201.78±18.54*## 4.73±0.76##硫普羅寧組 100 3.46±0.51## 208.38±12.90## 5.04±0.41##

2.5 CⅡ-3對大鼠肝臟組織病理學的影響 光鏡下可見，正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細胞索排列整齊，呈放射狀排列，肝竇正常，胞核結(jié)構(gòu)清晰，肝細胞結(jié)構(gòu)完整；模型組大鼠肝小葉界限不清，肝細胞索紊亂，肝竇變窄，胞漿內(nèi)出現(xiàn)彌漫性大小不等的脂滴，可見點狀壞死和炎性細胞浸潤，胞核模糊不清；各治療組損傷有不同程度的減輕，以高劑量組和陽性組較為明顯，肝小葉結(jié)構(gòu)較清晰，肝細胞索排列整齊，肝竇基本恢復正常，胞漿中偶見少量的脂滴。見圖1。

圖1 CⅡ-3對大鼠急性酒精性肝臟損傷后肝臟組織形態(tài)學的影響（×400）

3 討論

肝臟是體內(nèi)代謝乙醇的主要場所，乙醇被機體吸收后，約90%在肝臟內(nèi)代謝。乙醇在肝臟經(jīng)乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶脫氫氧化為乙醛和乙酸，再通過體循環(huán)而被人體代謝。此過程中肝細胞內(nèi)產(chǎn)生較多的活性氧自由基（ROS），包括O2·－、H2O2、·OH、C2H5O·和C2H5OH，這些自由基具有極強氧化能力，會攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引起脂質(zhì)過氧化，并產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，進而造成肝細胞膜通透性增加和肝細胞內(nèi)線粒體損傷，最終導致肝細胞功能和結(jié)構(gòu)的損害〔10-11〕。

MDA是氧自由基與生物膜多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，MDA含量可以間接的反映出機體細胞受自由基攻擊的程度，MDA的增加表明組織細胞脂質(zhì)過氧化物量的增加，故檢測MDA同時可反映氧自由基的水平及脂質(zhì)過氧化的程度〔12〕。SOD是機體內(nèi)清除自由基的重要抗氧化酶之一，SOD及MDA含量的高低可反映氧自由基水平和脂質(zhì)過氧化的強度與速率。GSH是一種低分子清除劑，對脂質(zhì)過氧化自由基具有較強的清除作用，GSH在抵抗酒精所致的肝損傷中起關(guān)鍵作用，酒精在體外和體內(nèi)均可使肝臟GSH含量顯著降低，GSH含量的減少可能是酒精導致肝臟脂質(zhì)過氧化增強的原因之一〔13-14〕。實驗結(jié)果顯示：模型組大鼠肝組織MDA水平明顯高于正常組，SOD和GSH的水平明顯低于正常組，而且CⅡ-3各劑量組能夠降低肝組織中MDA水平及升高SOD水平，推測其可能通過抗脂質(zhì)過氧化反應(yīng)而產(chǎn)生較好的肝臟保護作用。

ALT是反映肝細胞損害最直接和最敏感的指標，主要位于肝細胞胞漿內(nèi)，當飲酒過多造成急性酒精性肝損傷時，肝細胞受損、肝細胞膜通透性增加，胞漿內(nèi)ALT升高，同時借助于濃度梯度透過細胞膜，進入血循環(huán)，引起肝組織和外周血清中ALT濃度的升高。而AST主要位于肝細胞線粒體內(nèi)，飲酒過多后可造成肝細胞嚴重受損、線粒體水腫變性，肝組織和血清AST濃度也可明顯升高〔15〕。本實驗顯示，模型組血清ALT、AST平均水平顯著高于空白組（P＜0.01），說明急性酒精性肝損傷模型造模成功。CⅡ-3可顯著降低血清ALT、AST水平，表明CⅡ-3能夠減輕酒精對肝細胞造成的損傷，對肝細胞有一定的保護作用。

本實驗結(jié)果顯示：CⅡ-3能促進急性酒精性肝損傷大鼠的功能恢復，降低血清AL、AST的活性和TG的含量；提高肝內(nèi)抗氧化酶SOD及GSH的活性，降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的含量，提示美洲大蠊提取物CⅡ-3可能是通過抗脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，抑制肝內(nèi)氧自由基的生成，從而對酒精所致大鼠急性肝損傷發(fā)揮一定保護作用。

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Protective Effects of Periplaneta Americana Extract CⅡ-3 against Acute Hepatic Injury Induced by Alcohol in Rats

ZHANG Xuqiang,HE Xu,CHEN Junya,HU Wenshuai,PENG Fang*
（School of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To investigate the protective effects of CⅡ-3,which was extracted from Periplaneta americana against acute hepatic injury induced by alcohol in rats.Methods:The rat model of acute hepatic injury was induced by stomach perfusion with 56° Red Star Liquor for 10 days and different doses of CⅡ-3 treatment.At the 11th day of the treatment,the ALT,AST,TG in rat serum and GSH,SOD,MDA in liver homogenate were measured.At the end of the treatment,the rats were euthanized and the hepatic tissues were conduct to the histopathological examination.Results:Compared with the control group,CⅡ-3 treatment could remarkably reduce the levels of ALT,AST,TG and MDA(P＜0.01),and increase the levels of SOD and GSH(P＜0.01);furthermore,CⅡ-3 treatment could mitigate hepatocyte fatty degeneration,cellular necrosis and inflammatory infiltration.Conclusion:CⅡ-3 extracted from Periplaneta americana may prevent rats from acute hepatic injury induced by alcohol.

Periplaneta americana;alcohol-induced hepatic injury;protective action

R285.5［文獻標志碼］A［文章編號］1672-2345（2011）12-0001-05

2011-06-15

2011-09-01

張旭強，2009級藥物化學碩士研究生.

*通信作者：彭芳，教授，碩士研究生導師.

（責任編輯 毛本勇）