微滲析-微分析聯用技術在活體研究中的應用

楊志勇

（大理學院藥學與化學學院，云南大理 671000）

微滲析-微分析聯用技術在活體研究中的應用

楊志勇

（大理學院藥學與化學學院，云南大理 671000）

微滲析取樣是一種高效的生物活體取樣技術，可與多種微納分析設備組成聯用對活體進行實時、在線分析。本文評述其技術原理、聯用方式，應用范圍及其局限性，并對其發展趨勢進行預測，引用文獻31篇。

微滲析；活體取樣；在線聯用；評述

1 引言

在生命醫學、藥理學、神經科學研究中，微滲析（Microdialysis，MD）是一種廣泛用于體內研究藥物的取樣技術〔1-3〕。較之取血或組織勻漿法等傳統取樣方法，MD具有以下顯著優勢：①提供作用部位的藥物濃度及其代謝變化等信息；②樣品不含蛋白質、酶等大分子物質，只含游離的藥物；③樣品無需復雜的分離凈化處理，無體液損失，組織損傷小；④可持續取樣，獲得藥物代謝中間過程信息；⑤可在同一臟器的不同區域或多個臟器同時取樣，研究藥物在同個臟器中不同區域或不同臟器的分布和代謝；⑥可在清醒、自由活動的動物個體上取樣，在接近正常生理條件下得到實驗結果，更有科學性和實際意義。

因此，微滲析是一種在不破壞（或很少破壞）生物體內環境的前提下，對生物體細胞間液的內源性或外源性物質進行連續取樣的技術。

2 微滲析技術

2.1 微滲析技術的原理 當取樣探針插入生物體取樣部位后，探針上的滲析膜對生物大分子如酶等可進行過濾截留，小分子物質通過滲析膜的擴散遵守Fick’s擴散定律。當灌流液以一定速度通過微滲析探針，在膜的兩側則產生了濃度梯度。如果探針周圍組織中藥物的濃度（細胞外液，Extracellular Fluid）大于灌注液中的濃度，藥物會擴散進入探針中（見圖1）。此時，將藥物在滲析液中的濃度（Cd）和在組織液中的濃度（Cm）的比值稱為回收率（相對回收率，relative recovery）R=Cd/Cm〔4〕。

2.2 探針回收率的測定 探針的回收率測定是微滲析定量的基礎。目前常用的幾種探針回收率測定的方法主要有：無凈流出量變化點法（point of no net flux）〔5〕；動態無凈流出量變化點法（dynamic no net flux）〔6〕，反向滲析法（Retrodialysis）〔7〕。

一般認為，探針回收率是由膜的有效面積、膜的材料特性〔8〕、灌注液流速、被測物質性質及取樣溫度決定的〔9〕。

圖1 微滲析取樣原理圖〔3〕

2.3 微滲析技術的局限性 與任何一項取樣技術一樣，微滲析用于體內取樣時也存在局限性。盡管微滲析取樣探針的尺寸比較小，在手術植入探針過程中對組織、臟器依然會造成創傷；同時，由于探針的物理結構，使其在精細部位如大腦局部區域取樣的空間分辨率不夠，所以，取樣只能是接近于動物的正常生理狀態下的試驗結果。

此外，微滲析回收率與灌流速度是一對矛盾〔10〕，在使用微滲析技術時，往往要在灌流速度、方法回收率和時間分辨率等因素間進行條件優化。

3 微滲析與分析技術的聯用

3.1 離線分析（Offline approaches） 微滲析取樣是持續性的過程，而大多數的分析方法從進樣到完成分析是間歇性的。早先的微滲析取樣-分析技術中，往往采用將樣品集中收集，而后進行統一的分析，即所謂離線分析。此時，進樣量和灌流速度決定了能得到的最高的時間分辨率。顯然，離線分析無法對活體實時分析；而自樣品采集至進樣分析過程中的任何的衍生、萃取等前處理都將導致實驗結果產生很大的誤差。

3.2 在線分析（Online approaches） 由于滲析液中不含蛋白質，故可直接進樣分析，即所謂微滲析與分析系統在線聯用。在線聯用系統中，探針能夠在兩次分析的間隔時間完成取樣。所以，分析速度將決定總體的時間分辨率。對于在線聯用、尤其是實時分析而言，需考慮所建立的分析方法的時間分辨率是否足夠完成所研究的生理過程。

3.2.1 微滲析-高效液相色譜（MD-LC） 微滲析與窄徑柱高效液相色譜（Microbore liquid chromatography，MLC）聯用是迄今為止最常見的在線聯用方式。MD-MLC系統通常由LC泵，配有定量環的進樣器、色譜柱、檢測器、數據記錄儀等組成（見圖2）。

圖2 微滲析-高效液相色譜聯用裝置示意圖〔11〕

MLC常采用反相柱或離子交換柱，具有高靈敏度，分析速度快的特點。在MD-MLC中，所有引起譜帶展寬，進樣死體積和檢測池死體積都應該避免，連接管路的長度應盡可能縮短〔12〕。

MD-MLC聯用技術的關鍵在于二者之間的接口。采用傳統的六通閥進樣，由于滲析液不能完全進入色譜柱而引起進樣誤差。由此，發展出了多定量環技術，使滲析液自探針分別進入兩個或多個定量環，從而減少進樣誤差并保證一定的時間分辨率。

McLaughlin等分別采用窄徑柱和常規色譜柱對安定及其代謝物進行測定，系統時間分辨率分別為14、23 min〔13〕；Mathy等使用窄徑柱（1×150 mm）對氟康唑在老鼠血液和皮膚中的濃度進行同時在線監測，時間分辨率從40 min提高到24 min〔12〕。

毛細管柱色譜的內徑在50～500 μm，長度在5～200 cm范圍，較MLC有更小的進樣量和更高的分離效率。當其與MS進行聯用時，能使分析物更好的離子化，從而獲得更高的檢測靈敏度〔14〕。

在線的MD-LC分析中，檢測方式決定于分析對象及要求的檢測靈敏度。目前，紫外檢測仍然在藥代動力學研究中廣泛使用；電化學檢測能對單胺類等神經遞質進行高靈敏度檢測；熒光檢測具有較好的靈敏度，在MD-MLC系統聯用中較多被采用，但須對分析物進行衍生處理〔15〕。值得注意的是，由于質譜檢測不但具有較高的檢測靈敏度，同時能提供分析物質的結構信息。MD-MLC-MS被用于對體內乙酰膽堿的在線檢測和對雙氯芬酸的透皮過程研究〔16〕。

3.2.2 微滲析-毛細管電泳（MD-CE） 毛細管電泳具有進樣量小，分析速度快的特點，非常適合與MD聯用進行活體在線分析。MD-CE聯用有更好的時間分辨率。MD-CE的關鍵在于二者之間的接口技術。

Hogan等〔17〕在MD-CE接口應用一種可旋轉的微進樣閥，微進樣閥把連續的滲析流分割成為不連續的樣品塞流（每個60 nL），然后被緩沖液傳送至一個存有分離緩沖的緩沖池，在此，緩沖輸送毛細管出口與分離毛細管的進口保持一定間隙并準確對齊（見圖3）。通過電動進樣使樣品塞流進入CE，多余的樣品被后續的緩沖液沖離進樣位置。在這一接口中，非常仔細地對準傳輸毛細管和分離毛細管的管口，并保持二者之間有合適的間隙是操作成功的關鍵。

圖3 采用“間歇連接”接口的微滲析-毛細管電泳聯用裝置示意圖〔18〕

Lada和Kennedy〔19〕報道了另外一種接口技術，即流量控制接口。接口由兩塊鋼板夾住一個聚四氟乙烯墊片構成，鋼板上面開一小孔限制流量。滲析液探針的出口和毛細管的入口正好對齊并相距一個墊片的距離。鋼板的上下分別開有兩個小孔用于引入和放出電泳緩沖液，形成與滲析-電泳流路相垂直的另一流路（見圖4）。在電泳過程中，控制流路中的緩沖液從垂直方向沖洗探針引入滲析液并提供電泳所需的緩沖液。關閉控制流路時，滲析液沒有阻力進入毛細管從而完成進樣。在此系統中，也可通過斷開分離電壓使滲析液在毛細管入口處累積至一定濃度，然后電動進樣數秒，再斷開進樣電壓，此時，控制流路重新開始將多余的滲析液自毛細管入口處沖掉，重新升壓進行分離。控制流路接口具有極小的死體積，可控制探針中滲析液按nL級的流速流動，使系統的時間分辨率保持較低。這種進樣接口要求探針入口和毛細管入口必須完全對準。此外，控制流路的流速大小、滲析液在毛細管口富集時間均是保證接口正常工作的必要條件。

圖4 采用“流量控制”接口的微滲析-毛細管電泳聯用裝置示意圖〔19〕

Lada等〔19〕運用流量控制接口，結合MD-CEUV技術，對老鼠大腦中抗壞血酸鹽進行了測定，實驗的時間分辨率大概在110 s。

在檢測方式上，LIF檢測具有較高的靈敏度，可對多種生物活性物質進行檢測〔20〕，在MD-CE聯用中被廣泛采用；此外，電化學檢測也具有相對高的靈敏度，可對具有氧化還原活性的生物內源性物質進行檢測〔21〕。

由于CE進樣量較小，CE-MS較LC-MS的靈敏度偏低，因而MD-CE-MS的聯用方式較為少見。Takada等〔22〕報道單純采用CE-MS測定樣品中的y-氨基丁酸（GABA），其檢測限為10～5 m，采用微滲析自老鼠大腦中取樣后，但在同樣的分析條件下不能測出GABA。

3.2.3 微滲析-芯片電泳聯用（Microdialysis-microchip electrophoresis，MD-MC） MD與LC、CE聯用的問題之一在于分離設備體積過大，無法自由移動，在一些特殊場合，不便于對實驗動物進行實時分析。近年來，隨著芯片電泳技術的發展，MD-MC聯用技術得以發展。相對于傳統的CE，芯片電泳在手掌大小的一塊芯片上，將樣品制備、衍生、進樣和分離檢測集成在一起，具有更小的進樣量和更快的分離速度。

Huyhn等〔23〕首先報道了MD-MC聯用技術，芯片采用鈉鈣玻璃制備，并刻蝕雙T字通道，注射泵將緩沖液持續地灌流通過探針（4 mm CMA/12），并將滲析液通過PEEK管引入MC，PEEK管與MC之間通過一個密封套（Upchurch Scientific）實現連接。在分離通道垂直的方向施加阻斷電壓將連續的滲析液流分割為單個的塞流。系統被成功應用于對β-半乳糖苷酶活性的監測。當酶催化β-半乳糖苷酶中標記的熒光素釋放時，底物和產品均可采用LIF進行檢測。系統時間分辨率約5～7 min。

類似的裝置也被用于研究氨基酸、肽〔24〕，報道的時間分辨率達30～40 s。Kennedy小組則采用改進的MD-MC技術對體內氨基酸類神經遞質進行連續監測，時間分辨率為2～4 min〔25〕。

3.2.4 微滲析-生物傳感器聯用（Microdialysis coupled to biosensors） 生物傳感器可對生化過程中的物質進行識別并產生相應的電信號。由于沒有分離過程，生物傳感器與MD聯用時有較好的時間分辨率，但大多數生物傳感器只能對單一分析物進行檢測。生物傳感器的種類很多，大多利用酶反應產生電、光信號進行檢測。理想的生物傳感器可在一定的時間范圍內對病人的體液成分進行連續地監測。在線的MD-Biosensor聯用系統要求對復雜的生物環境中對分析物產生高靈敏度和選擇性的響應；同時，應能對極少的樣品量進行分析〔26〕。

Gramsbergen等采用MD-Biosensor研究了自由活動的老鼠在缺血條件下體內的葡萄糖、乳酸水平變化；實驗采用流動注射進樣，酶電極進行安培檢測〔27〕；也有報道采用傳感結合化學發光檢測對兔子體內的葡萄糖水平進行監測〔28〕。最近的研究是將亞甲綠吸附于單壁碳納米管制備電極，并與MD聯用，對老鼠大腦缺血和再灌注條件下葡萄糖及乳酸水平進行監測〔21〕。目前MD-Biosensor聯用技術可對葡萄糖、乳酸，丙酮酸〔29-30〕、谷氨酸、乙酰膽堿、多巴胺〔31〕，過氧化氫〔29〕等進行在線監測研究。

4 展望

目前，微滲析取樣主要用于對體內物質的動態變化進行連續性監測。這就要求對滲析液進行快速、靈敏的分析，以獲得滿意的時間分辨率。隨著各種微分離技術的進步，微滲析與它們之間的聯用將能夠更加準確、客觀地對體內生化過程進行實時分析。其中，微滲析-芯片電泳的聯用以其分析成本低、分速度快、較好的時間分辨率以及結構簡單、操作方便等優點尤為引人注目。可以預見，隨著芯片制造技術和接口技術的發展，將催生出可植入人或動物體內的微滲析-芯片電泳裝置，對生物體內過程進行監測。另外，對于LC、CE這些傳統的分離技術，采用質譜等高靈敏度檢測方法并結合微滲析取樣技術，將能夠更加廣泛地在生物、醫藥、環境等領域獲得應用。

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Application of Microdialysis-microanalysis Coupling Technique in Vivo Studies

YANG Zhiyong
（School of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Microdialysis sampling is an effective biological sampling technique in vivo,which has been coupled with many micronano analysis equipments for real-time，on-line analysis in vivo.In this review of 31 documents,the technical principle,combination mode,application range and limitation of microdialysis are stated and its development is predicted.

microdialysis;sampling in vivo;on-line coupling;review

R969［文獻標志碼］A［文章編號］1672-2345（2011）12-0016-05

大理學院博士科研啟動金項目（ky1019207610）

2011-04-12

2011-09-06

楊志勇，講師，博士，主要從事液相色譜、毛細管電泳技術在體內藥物分析中的應用研究.

（責任編輯 毛本勇）