HIV相關性口腔白色念珠菌rDNA基因型研究

張云操，劉 奇，武有聰，郭利軍，申元英，白 麗

（大理學院基礎醫學院，云南大理 671000）

HIV相關性口腔白色念珠菌rDNA基因型研究

張云操，劉 奇，武有聰，郭利軍，申元英，白 麗*

（大理學院基礎醫學院，云南大理 671000）

目的：了解HIV感染人群和健康人群口腔白色念珠菌基因型的分布情況。方法：運用CA-INT特異性引物聚合酶鏈反應方法擴增白色念珠菌包含1類內含子的編碼rRNA的25S rDNA區，根據擴增條帶大小進行基因分型，并應用χ2檢驗對54株HIV感染人群和54株健康人群口腔白色念珠菌基因型別進行分析。結果：CA-INT特異性引物PCR法可將108株口腔白色念珠菌分為A、B和C型，以A型最多見，兩組人群口腔白色念珠菌基因型分布基本相同，但HIV感染人群口腔白色念珠菌A型所占構成比高于健康人群，差別有統計學意義。結論：HIV感染人群和健康人群口腔白色念珠菌均具有基因多態性，CA-INT特異性引物PCR法是較好的口腔白色念珠菌種內菌株間鑒定的方法。

白色念珠菌；HIV；聚合酶鏈反應；rDNA基因型

口腔念珠菌病（oral candidiasis，OC）是一組由念珠菌屬感染所引起的口腔粘膜疾病，然而在口腔念珠菌感染中又以白色念珠菌（Candida albicans，CA）為最主要的條件致病菌。OC是HIV感染人群最常見的并發癥之一，機體一旦出現OC預示疾病即將從HIV感染期進入至AIDS發病階段，故其是早期發現和診斷AIDS的重要線索〔1〕。從基因水平對口腔白色念珠菌菌株間差異進行基因分型研究，能克服表型研究出現的缺點，無疑是能更好認識到OC流行病學的意義。本文采用特異性引物PCR分型方法，以分離來自HIV感染人群口腔白色念珠菌為研究對象，健康人群口腔白色念珠菌為對照，擴增白色念珠菌包含1類內含子的編碼rRNA的25S rDNA區，以探討2組人群口腔白色念珠菌基因型分布情況，并為HIV感染人群的OC分子流行病學研究提供方法。

1 材料與方法

1.1 材料 分離自云南大理地區HIV感染人群和健康人群的口腔念珠菌，經形態染色、培養特性、芽管形成實驗、假菌絲及厚膜孢子形成實驗、YBC酵母鑒定卡及CHROMagar培養基培養綜合鑒定為白色念珠菌，其中HIV感染人群分離到54株口腔白色念珠菌，健康人群分離到54株口腔白色念珠菌，質控菌株為ATCC10231（本教研室提供）。

1.2 方法

1.2.1 菌株DNA提取 參照文獻〔2〕修改后進行，實驗菌株在沙氏瓊脂培養基激活2次后，取單個菌落（直徑2 mm）加入含0.5 mL無菌去離子水的離心管中，然后室溫離心后，棄去上清；加入0.5 mL 0.25M Tris（pH8.0）-1.5%SDS裂解液，恒溫混勻儀上加熱100℃30 min，后搖勻2 min；加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）（pH＞7.8）混勻，室溫離心后取上清；加入1/10體積的3 mol/L乙酸鈉（pH5.2）和2.2倍體積的無水乙醇，混勻；室溫離心后，棄去上清，加入1 mL冰預冷的70%乙醇洗滌DNA后，室溫離心，棄去上清；室溫干燥后用30 μl 1×Tris-EDTA（pH7.6）重懸DNA，然后-20℃保存備用；用紫外分光光度計測定OD260/OD280，估計DNA純度和濃度，比值控制在1.8～2.1范圍較理想，-20℃保存備用。

1.2.2 PCR擴增 針對白色念珠菌25S rDNA轉座內含子保守序列分型，特異性引物參考文獻〔3〕設計。特異性引物：CA-INT-R（5′-CCTTGGCTGTGGTTTCGCTAGATAGTAGAT-3′）和 CA-INT-L（5′-ATAAGGGAAGTCGGCAAAATAGAT-CCGTAA-3′）（上海生工生物工程公司合成）。PCR反應條件參照2×Taq PCR MasterMix擴增試劑盒（購自北京天根生化科技有限公司）進行，反應總體積為25 μL，1 μL模板（＜1 μg），1 μl CA-INT-R（10 μM），1 μl CA-INT-L（10 μM），12.5 μL 2×MasterMix，ddH2O補至25μL。PCR反應循環的設置：94℃預變性3min，94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，共30個循環，72℃延伸5 min。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，凝膠成像系統照相分析，根據擴增產物中450 bp和840 bp的有無將白色念珠菌分為3種基因型，用SPSS17.0統計學軟件對2組人群口腔白色念珠菌基因型別進行χ2檢驗。

2 結果

2.1 PCR擴增結果 經CA-INT特異性引物PCR方法擴增后，2組人群的口腔白色念珠菌均可擴增出450 bp、840 bp或二者皆有的片段，根據PCR擴增產物中450 bp和840 bp的有無將兩組人群的口腔白色念珠菌基因型分為3型：A型（450 bp），B型（840 bp），C型（450 bp和840 bp）。見圖1。2組人群口腔白色念珠菌CA-INT引物PCR分型結果，見表1。2組人群均以A型白色念珠菌最為多見，標準株ATCC10231也屬于A型，另外B型次之以及C型較少。

表1 兩組人群口腔白色念珠菌CA-INT引物PCR分型結果

圖1 白色念珠菌25Sr DNA-PCR的部分圖譜

2.2 統計分析 HIV感染人群口腔白色念珠菌中A型所占構成比大于健康人群口腔白色念珠菌中A型所占構成比（表1），經χ2檢驗，P＜0.05，差別有統計學意義；而HIV感染人群口腔白色念珠菌中B型所占構成比小于健康人群口腔白色念珠菌B型所占構成比，經χ2檢驗，P＞0.05，差別無統計學意義；HIV感染人群口腔白色念珠菌中C型所占構成比小于健康人群口腔白色念珠菌C型所占構成比，經χ2檢驗，P＞0.05，差別無統計學意義。HIV感染人群和健康人群的口腔白色念珠菌基因型別分布經SPSS17.0 χ2檢驗結果顯示：χ2=4.282，P=0.118，按P=0.05水準，兩組間A、B和C基因型別分布差異無統計學意義。

3 討論

隨著白色念珠菌感染在臨床病例中不斷增加，耐藥現象逐漸突出，對白色念珠菌病流行病學及合理選擇抗真菌藥物的研究顯得十分重要。近年來，PCR分型方法已被廣泛的應用于對念珠菌間的DNA核苷酸序列的差異進行基因分析研究，用于臨床分離株快速分型，追蹤念珠菌感染的傳染源，明確傳播途徑，防止爆發流行，確定同一患者反復感染是源于復發或再感染等研究，并表現出簡易、快速、可靠，重復性好等優點〔4〕。運用CA-INT引物PCR法是進行白色念珠菌基因分型的方法之一，CA-INT引物是針對白色念珠菌的可換位基因內區（CA25SRRN）設計的特異引物，在白色念珠菌25S rDNA的CA25SRRN插入一個大小為379 bp的基因，即可擴增出840 bp片段（B組），沒有插入該基因則擴增450 bp片段（A組），兩種片段都有則擴增840 bp片段和450 bp片段（C組），后者可能是真菌有性生殖的結果，此方法設計科學合理、簡便快速、結果穩定、準確可靠，適合臨床推廣應用〔3，5〕。本文采用CA-INT PCR基因分型方法，對54株HIV感染人群和54株健康人群口腔白色念珠菌進行基因型分析，發現2組人群口腔白色念珠菌均可擴增出清晰而穩定的條帶，均具有A、B和C型，均以A型最多見，B型次之，C型最少，3種基因型的分布情況與文獻〔6-7〕報道一致。本研究結果顯示HIV感染人群口腔白色念珠菌A型所占構成比要高于健康人群，其原因可能由于HIV感染人群口腔與健康人群口腔局部微生態環境不同，影響了白色念珠菌的寄生環境而致寄生菌株發生差異，確切的原因有待進一步研究。武有聰〔2〕等采用隨機引物P2-RAPD方法對同一組HIV感染人群的口腔白色念珠菌進行基因型研究，將其分為11個基因型，而本研究采用特異性INT引物法將這些白色念珠菌分成3個基因型，可見隨機引物RAPD法分辨率高于特異性INT引物法，但特異性INT引物分型法所擴增的白色念珠菌基因條帶清晰而穩定，檢測成功率為100%，故認為CA-INT引物PCR法結果穩定、準確可靠、直觀。因此，特異性CA-INT引物PCR法是較好的白色念珠菌種內菌株間鑒定的方法，可用于白色念珠菌基因型與表型關系研究，對確定口腔念珠菌病的復發和再感染及其分子流行病學研究均具有重要意義。

〔1〕Fidel PL Jr.Candida-Host interactions in HIV disease：implications for oropharyngeal candidiasis〔J〕.Adv Dent Res，2011，23（1）：45-49.

〔2〕武有聰，白麗，袁有華，等.HIV相關性口腔念珠菌RAPD多態性分析〔J〕.微生物學通報，2009，36（5）：728-734.

〔3〕Nawrot U，Pajaczkowska M，Wtodarczyk K，et al.rDNA-based genotyping of clinical isolates of Candida albicans〔J〕.Pol J Microbiol，2010，59（3）：213-216.

〔4〕JewtuchowiczVM，MujicaMT，BruscaMI，etal.Phenotypic and genotypic identification of Candida dubliniensis from subgingival sites in immunocompetent subjects in Argentina〔J〕.Oral Microbiol Immunol，2008，23（6）：505-509.

〔5〕Hattori H，Iwata T，Nakagawa Y，et al.Genotype analysis of Candida albicans isolates obtained from differentbody locations of patients with superficial candidiasis using PCRs targeting 25S rDNA and ALT repeat sequences of the RPS〔J〕.J Dermatol Sci，2006，42（1）：31-46.

〔6〕Nawrot U，Skala J，Wlodarczyk K，et al.Proteolytic activity of clinical Candida albicans isolates in relation to genotype and strain source〔J〕.Pol J Microbiol，2008，57（1）：27-33.

〔7〕Jayaguru P and M.Raghunathan.Group I intron renders differential susceptibility of Candida albicans to bleomycin〔J〕.Mol Biol Rep，2007，34（1）：11-17.

rDNA Genotyping of Oral Candida albicans Isolated from HIV-infected Population

ZHANG Yuncao，LIU Qi,WU Youcong，GUO Lijun，SHEN Yuanying，BAI Li*
（School of Basic Medicine,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To investigate the distribution of genotypes of oral Candida albicans isolated from HIV-related group and healthy carriers group.Methods:PCR with CA-INT primers was designed to amplify group 1 intron-containing region in 25S rDNA of oral Candida albicans,the different strains of oral Candida albicans were classified into genotypes on the basis of bands from amplicons.Then the genotypic distribution results of all oral Candida albicans were analyzed with SPSS 17.0 by chi-square test. Results:One hundred and eight strains of oral cavities Candida albicans were classified into genotype A,B and C.Genotype A was the most predominant one.Identical genotypes distribution appeared in both groups.But the constituent ratio of genotype A of oral Candida albicans strains in HIV-positive group was statistically higher compared to the healthy people group.Conclusion:Genotypes of oral Candida albicans in both groups were highly polymorphic.The method in text is suitable to apply in genotyping research of oral Candida albicans.

Candida albicans;HIV;PCR;rDNA genotyping

R378.99［文獻標志碼］A［文章編號］1672-2345（2011）08-0024-03

國家自然科學基金資助項目（C30260005）；大理學院高層次人才基金資助項目（KY430440）

2011-06-09

張云操，碩士研究生，主要從事病原生物學研究.

*通信作者：白麗，教授.

（責任編輯 董 杰）