響應面法優化植酸酶水解大豆分離蛋白的工藝

張仁楠，姚 磊，富校軼，，*

(1.東北農業大學，黑龍江哈爾濱150030;2.國家大豆工程技術研究中心，黑龍江哈爾濱150030)

響應面法優化植酸酶水解大豆分離蛋白的工藝

張仁楠1，姚 磊2，富校軼1，2，*

(1.東北農業大學，黑龍江哈爾濱150030;2.國家大豆工程技術研究中心，黑龍江哈爾濱150030)

以大豆分離蛋白為實驗材料，在酶解溫度、酶添加量、pH、水解時間等單因素實驗的基礎上，根據Box-Behnken中心組合實驗設計原理，采用四因素三水平響應曲面分析法，依據回歸分析確定各工藝條件的主要影響因素，以大豆分離蛋白中植酸的去除率為響應值作響應面。植酸去除的最佳工藝條件為:反應溫度44.87℃，酶添加量為8.24%，pH為5.54，反應時間為3.03h。在最佳工藝條件下，植酸的去除率為95.15%，驗證實驗結果為94.98%。

大豆分離蛋白，植酸，植酸酶，響應面

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆分離蛋白 購自哈工大;植酸酶 購自Sigma公司(小麥中提取，0.03U/mg);其它試劑 分析純。

電子天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司; TU-1901雙光速紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;Z36HK低溫高速離心機 德國Hermle公司;高速離心機，PP-25E型酸度計，HH-8恒溫水浴鍋。

1.2 實驗方法

1.2.1 植酸的測定 采用測鐵分光光度法于500nm測定植酸的含量［10］。

1.2.2 影響植酸去除率的單因素實驗 以植酸去除率為指標，分別選取水解溫度，酶添加量，pH和水解時間進行植酸酶酶解大豆分離蛋白的單因素實驗。

1.2.3 響應曲面法實驗設計 采用Box-Behnken模型，以水解溫度，酶添加量，pH和水解時間為主要考察因素。因素水平編碼見表1。

表1 因素水平編碼

2 結果與討論

2.1 反應溫度對植酸去除率的影響

取10mL離心管20支，(共五個溫度點，每個溫度點一個對照管三個實驗管)。每管均加入待測樣品0.1g左右，加入乙酸緩沖液4mL，分別在30、35、40、45、50、55℃恒溫振蕩水浴中溫浴30min。

在上述實驗管中分別加入酶溶液0.5mL，在旋渦混合儀上迅速混合后放入水浴鍋中，在加酶后的1h，按與加入酶液相同的順序加終止液硝酸(1+3)使酶失活。考察不同反應溫度對植酸去除率的影響，結果見圖1。

圖1 溫度對植酸去除率的影響

由圖1可見，溫度在30～45℃之間時，植酸的去除率隨著溫度的增加而增加。但當溫度大于45℃時，植酸的去除率隨溫度的升高而下降。植酸酶的最適溫度約為45℃，符合植物性植酸酶的最適溫度(45～60℃)。所以，在下面的響應面實驗設計中植酸酶水解溫度選擇40～50℃。

2.2 酶添加量對植酸去除率的影響

取10mL離心管20支，(共五個溫度點，每個溫度點一個對照管三個實驗管)。每管均加入待測樣品0.1g左右，加入乙酸緩沖液4mL，37℃恒溫振蕩水浴中溫浴30min。

在上述實驗管中分別加入 1.34%、2.68%、5.36%、8.04%、10.72%的酶液，在旋渦混合儀上迅速混合后放入水浴鍋中，在加酶后的1h，按與加入酶液相同的順序加終止液硝酸(1+3)使酶失活。考察不同酶添加量對植酸去除率的影響，結果見圖2。

從圖2可見，隨著酶添加量的增加，植酸的去除率逐漸增加，酶添加量為8.04%時水解效果好。所以，在下面的響應面實驗設計中植酸酶的添加量選擇5.36%～10.72%。

2.3 pH對植酸去除率的影響

圖2 酶添加量對植酸去除率的影響

取10mL離心管36支，(共九個pH點，每個pH點一個對照管三個實驗管)。每管均加入待測樣品0.1g左右，加入乙酸緩沖液4mL，調節pH，在37℃恒溫振蕩水浴中溫浴30min。

在上述實驗管中分別加入酶溶液0.5mL，在旋渦混合儀上迅速混合后放入水浴鍋中，在加酶后的1h，按與加入酶液相同的順序加終止液硝酸(1+3)使酶失活，考察不同pH對植酸去除率的影響。結果見圖3。

圖3 pH對植酸去除率的影響

由圖3可見，pH 2.5～5.5時，植酸的去除率隨pH增加而升高。pH為5.5時植酸的去除率達到最大值，效果最好。植酸酶的最適pH約為5.5，符合植物性植酸酶的最適pH 4～6。所以，在下面的響應面實驗設計中植酸酶水解pH選擇5.0～6.0。

2.4 反應時間對植酸去除率的影響

取10mL離心管28支，(共七個溫度點，每個溫度點一個對照管三個實驗管)。每管均加入待測樣品0.1g左右，加入乙酸緩沖液4mL，加入到37℃恒溫振蕩水浴中溫浴30min。

在上述實驗管中分別加入酶溶液0.5mL，在旋渦混合儀上迅速混合后放入水浴鍋中，分別在加酶后的0.5、1、2、2.5、3、3.5、4h，按與加入酶液相同的順序加終止液硝酸(1+3)使酶失活。考察不同反應時間對植酸去除率的影響，結果見圖4。

圖4 不同反應時間對植酸去除率的影響

從圖4可見，水解時間小于3h時，植酸的去除率呈上升趨勢，酶與底物反應需要一定的時間;之后植酸的去除率趨于不變，可見底物完全被水解。因此，水解時間為3h時效果最好。所以，在下面的響應面實驗設計中植酸酶水解時間選擇2.5～3.5h。

2.5 響應曲面法實驗結果

2.5.1 模型建立 根據實驗因素與水平的設計，采用不同的反應溫度，酶添加量，pH和反應時間。進行29次實驗。各因素安排及結果見表2。

表2 實驗設計與結果

對表2在不同條件下所測得的植酸去除率，利用Design expert 7.1統計軟件進行回歸擬合，得到植酸去除率(Y)的回歸方程:

2.5.2 模型方差分析 利用Design expert 7.1統計軟件進行二次多元回歸擬合，得到回歸方程模型的方差分析和回歸方程系數估計值，見表3。

回歸方程中各變量對指標(響應值)影響的顯著性，由F檢驗來判定，概率P的值越小，則響應變量的顯著性越高。由表3可知，四個因素的Prob＞F值相差較大，對提取結果的影響順序為:酶添加量＞pH＞水解溫度＞水解時間。從方差分析可以看出模型Prob＞F值小于0.01，表明該模型方程高度顯著，不同處理間的差異高度顯著。模型失擬項的Prob＞F值0.8833＞0.05，模型失擬項不顯著，模型選擇合適。由此可見，各具體實驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關系。相關系數 R2=3082.37/3186.16= 0.967(大于0.8)，說明植酸去除率(Y)實際值與預測值之間具有較好的擬合度，因此該模型可用于預測響應值植酸去除率(Y)的實際情況。

表3 回歸方程的方差分析

2.5.3 響應曲面分析與最優工藝條件的確定 根據回歸分析結果，做出相應曲面圖，如圖5～圖8所示。從相應曲面分析圖上可以找到最佳參數及各參數之間的交互作用。

圖5 酶添加量與溫度的交互作用

圖6 溫度與pH的交互作用

圖5～圖8直觀地反映了各因素對響應值的影響。比較4組圖可知，水解時間、水解溫度、酶添加量和pH對植酸的去除率影響均較為顯著，表現為曲線較陡。

植酸去除率的響應面趨勢呈拋物線形，因此回歸方程有極大值，結合方程與響應曲面可得到植酸酶水解大豆分離蛋白中植酸的最優參數為:反應溫度44.87℃，酶添加量為8.24%，pH為5.54，反應時間為3.03h，植酸的去除率為95.15%。

圖7 酶解時間與酶添加量的交互作用

圖8 水解時間與pH的交互作用

根據最佳工藝條件，做三組驗證性實驗，結果如表4所示。

表4 最佳工藝條件驗證結果

由表4可以看出，在所得的最佳工藝條件下植酸的去除率與預測值接近，因此進一步驗證了實驗結果。

3 結論

通過單因素實驗以及在此基礎上通過四因素三水平響應面法實驗，建立了響應值與各因素之間的數學模型，依此模型可以預算理論植酸去除率。用響應面分析法對植酸酶水解大豆分離蛋白的工藝參數進行優化，得到的回歸方程為:

對植酸去除率影響較大的四個因素的Prob＞F值相差較大，對提取結果的影響順序為:酶添加量＞pH＞水解溫度＞水解時間。根據回歸模型，確定植酸酶水解大豆分離蛋白的最佳工藝參數:反應溫度為44.87℃，酶添加量為8.24%，pH為5.54，反應時間為3.03h，在此條件下，植酸的去除率為95.15%，驗證實驗結果為94.98%。

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Optimization of phytase hydrolysis of soybean protein isolated by response surface methodology

ZHANG Ren-nan1，YAO Lei2，FU Xiao-yi1，2，*
(1.Northeast Agricultural University，College of Food Science，Harbin150030，China; 2.The National Research Center of Soybean Engineering and Technology，Harbin 150030，China)

With soybean protein isolated as experiment material，on the base of single factor experiments(hydrolysis time，hydrolysis temperature and so on)，then through the experimental design of response surface methodology with four factors and three levels based on the principle of Box-Behnken design，the conditions of hydrolysis were studied.The optimal hydrolysis conditions:hydrolysis temperature was 44.87℃，exterior phytase addition about 8.24%，pH was 5.54，hydrolysis time was 3.03h.Experiments that checked the optimal hydrolysis time conditions showed that phytate of soybean protein isolated was degraded about 95.15%，proof test result was 94.98%.

soybean protein isolated;phytate;phytase;response surface methodology

TS201.2+1

B

1002-0306(2011)11-0292-04

植酸，化學名環乙六醇六磷酸酯(IP6)，廣泛存在于谷類、水果、蔬菜和干果等植物性食物中［1］。大豆中60%～80%的磷都是以植酸態的形式存在的，大豆中的植酸含量可達2%。植酸是一種很強的絡合劑，其12個酸基在腸胃中能牢固地絡合帶正電荷的Zn2+、Cu2+、Ca2+、Mg2+、Fe2+等二價和多價金屬離子，形成難溶性的植酸鹽絡合物，從而影響這些元素的吸收。另外，植酸還能與大豆蛋白或一些酶結合，形成植酸蛋白質復合物，影響蛋白質的生理功能［2-5］，降低食品的營養價值。植酸酶是一種特殊的酸性磷酸酶［6］，能催化水解植酸植酸鹽向正磷酸鹽及其他磷酸肌醇中間產物轉化，從而釋放出磷酸根離子［7］，把原來無法利用的磷變為有效磷而被動物吸收利用，間接地起到補充磷的作用［8］。關于谷物中植酸去除的研究不少，但方法不一，效果也不盡相同［9］。本實驗將響應曲面法(response surface methodology，RSM)應用于植酸酶去除大豆分離蛋白中植酸工藝的優化，以期獲得最優的工藝參數，從而改善植酸去除的效果，為大豆產品的開發利用奠定基礎。

2010-09-07 *通訊聯系人

張仁楠(1987-)，女，碩士，主要從事糧食、油脂與農產品加工及儲藏方面的研究工作。

國家“863”計劃項目(2006AA10Z332);黑龍江省青年基金項目(41400075-6-08003)。