驢骨蛋白多肽對小白鼠抗疲勞作用的研究

繆福俊，熊 智，吳本行，董繼文，孫 浩，李 彪，康 柳

(西南林業大學，西南山地森林資源保育與利用省部共建教育部重點實驗室，云南昆明650224)

驢骨蛋白多肽對小白鼠抗疲勞作用的研究

繆福俊，熊 智*，吳本行，董繼文，孫 浩，李 彪，康 柳

(西南林業大學，西南山地森林資源保育與利用省部共建教育部重點實驗室，云南昆明650224)

研究驢骨酶解產物蛋白多肽對小鼠的抗疲勞作用，對利用廢棄驢骨蛋白資源來開發其深加工產品具有重要意義。通過對小鼠灌胃不同劑量的驢骨蛋白多肽粉(專利申請號:201010198758.2)，經30d后測定小鼠體重、負重游泳力竭時間、肝糖原和血乳酸的含量，研究驢骨蛋白多肽的抗疲勞生理活性。結果表明:驢骨蛋白多肽粉對小鼠體重增長無明顯影響，但是能明顯延長小鼠負重游泳時間，降低血乳酸含量，增加肝糖原含量。說明驢骨蛋白多肽粉具有緩解小鼠疲勞反應、增加小鼠抗疲勞的作用，為利用驢骨資源提供科學的理論依據。

驢骨，蛋白多肽，抗疲勞

1 材料與方法

1.1 實驗材料

新鮮驢腿骨 云南楚雄養驢基地提供;木瓜蛋白酶 活力15萬U/g;昆明種雄性小鼠 昆明醫學院實驗室提供(動物生產許可證:SCXK(滇)2005-0008)，120只，體重(20±2)g。

1.2 驢骨蛋白多肽粉的制備

驢骨蛋白質含量測定方法:凱氏定氮法［11］。

驢骨多肽提取工藝:采用酶解工藝:

新鮮驢腿骨→砸碎→高壓蒸煮→骨湯共同粉碎→分離脂肪→骨粉懸浮液→酶解→濃縮、干燥→驢骨多肽粉(此工藝已經申請國家發明專利，申請號:201010198758.2)。

1.3 酶解液分析

氮溶出率的測定(NSI)［12］:氮溶出率(%)=酶解液總氮量/骨粉中總氮量×100%。

三氯乙酸溶解指數(TCA-NSI)的測定［12］:TCANSI(%)=上清液中總氮量/酶解液中總氮×100%。

1.4 小鼠抗疲勞實驗

1.4.1 小鼠分組 將120只昆明種系實驗小白鼠隨機分為4組，即空白對照組和3個受試物組，每天灌胃劑量為(低劑量組:1.2g/kg、中劑量組:3.5g/kg、高劑量組:7.0g/kg)，空白對照灌胃同體積生理鹽水。灌胃期間，自由進食(合成鼠料)、飲水，連續灌喂30d后進行以下實驗。

表2 驢骨蛋白多肽粉對小鼠負重游泳時間的影響

1.4.2 抗疲勞實驗 根據衛生部《保健食品檢驗與評價技術規范》(2003年版)的方法［13］，測定小鼠體重、負重游泳時間﹑血乳酸和肝糖原含量。

小鼠游泳實驗:末次給予受試物30min后，將尾根部負荷5%體重鉛皮的小鼠置于游泳箱中游泳。箱中水深不少于30cm，水溫(25±1)℃，記錄小鼠自游泳開始至死亡的時間。

肝糖原測定:末次給予受試物30min后，于25℃水中不負重游泳90min處死動物，取肝臟經生理鹽水漂洗后用濾紙吸干后置于冰面上的平皿內，迅速稱取肝臟200mg，測定肝糖原含量(蒽酮法)。

血乳酸測定:末次給予受試物30min后，將動物置溫度為25℃的水中不負重游泳20min，并于游泳后立即采眼球血20μL，測定乳酸含量。

1.5 統計方法

對實驗結果進行統計處理，采用t檢驗來比較。

2 結果與分析

2.1 驢骨蛋白質含量的測定

經凱氏定氮儀測定，驢骨蛋白質平均含量為25.25%，比豬骨蛋白含量12.0%，牛骨蛋白含量11.5%等的含量要高出十個百分點，說明驢骨中蛋白的含量較其它動物的骨蛋白含量高，其開發利用價值巨大。

2.2 酶解液特性分析

骨蛋白的溶解度大小，無論對理論研究還是實際應用都是十分重要的。NSI是樣品中能夠溶于特定溶劑中的氮占總氮的百分率，TCA-NSI的高低反映了酶解產物的生化特性，以及產品中肽鏈的長短，一般認為TCA-NSI越大，肽鏈越短。小分子肽類具有良好酸溶性、低黏度、良好生理活性、在體內消化吸收快、利用率高等優點。

從表1可知，水解產物pH在3～11范圍內NSI高達75%，且pH在5～9之間NSI可達到88%。說明驢骨蛋白酶解產物具有高溶解性，在相當寬的pH范圍內pH的影響較小。經測定酶解產物的TCANSI為84%，說明其水解產物絕大部分為低分子肽類。這兩個特點決定驢骨蛋白酶解產物可直接應用于食品中。

表1 酶解液在不同的pH下的NSI

2.3 抗疲勞實驗

2.3.1 驢骨蛋白多肽粉對小鼠體重及負重游泳實驗

由表2可見，各組小鼠灌胃30d后，經t檢驗，體重變化無顯著性差異(P＞0.05)，說明驢骨蛋白多肽粉對小鼠的體重沒有明顯影響。各劑量組的小鼠負重游泳時間隨著劑量的增多而延長，均高于對照組，中劑量組與對照組的差異達到顯著水平(P＜0.05)，高劑量組與對照組的差異達到極顯著水平(P＜0.01)。說明驢骨蛋白多肽粉對小鼠的運動耐力有明顯的增強作用，而運動耐力的提高是抗疲勞能力加強最有力的宏觀表現。

2.3.2 驢骨蛋白多肽粉對小鼠肝糖原的影響 糖原是運動能量的重要來源，糖原的儲存量可以直接影響機體的運動能力，肝糖原含量直接反映機體糖原代謝情況。機體在劇烈運動時肝糖原耗竭，導致葡萄糖異生作用受抑制，血糖濃度降低，使中樞神經系統發生干擾而出現疲勞［14］。由表3可見，各劑量組的小鼠肝糖原含量隨著劑量的增加而明顯增多，表明驢骨蛋白多肽粉能促進小鼠機體中的糖原含量，中、高劑量組與對照組相比，經t檢驗，差異分別達到顯著水平(P＜0.05)和極顯著水平(P＜0.01)，即劑量的高低能直接影響機體中糖原的量，對機體抗疲勞有明顯的促進作用。

表3 驢骨蛋白多肽粉對小鼠肝糖原含量的影響

2.3.3 驢骨蛋白多肽粉對小鼠運動后血乳酸含量的影響 乳酸的積累是運動性疲勞產生的重要因素，其乳酸含量變化對評價受試動物的抗疲勞作用非常靈敏。由于肌肉在劇烈收縮時供應的氧有限，肌細胞內糖原和葡萄糖分解的同時產生大量乳酸。乳酸的增加使肌肉中pH下降，導致疲勞［15-16］。由表4可見，小鼠的血乳酸隨著劑量的增加而明顯減少，中、高劑量組小鼠運動后血乳酸含量明顯降低，經t檢驗，差異分別達到顯著水平(P＜0.05)和極顯著水平(P＜0.01)。表明驢骨蛋白多肽粉能降低小鼠機體的血乳酸量，在中、高劑量時其作用效果顯著，能有效地緩解小鼠運動性疲勞。

表4 驢骨蛋白多肽粉對小鼠運動后血乳酪含量的影響

3 結論

驢骨蛋白經木瓜蛋白酶水解后其酶解產物在pH5～9范圍內，氮溶解指數高于88%，三氯乙酸氮溶解指數達84%。該酶水解的產物具有較高的溶解性，大部分為低分子肽，可直接應用于食品中。

驢骨蛋白多肽粉受試樣品可延長小鼠負重游泳時間、提高小鼠肝糖原的含量、降低運動后的血乳酸含量，且與對照組相比差異顯著。依據衛生部《保健食品檢驗與評價技術規范》(2003年版)緩解體力疲勞功能的標準判斷，驢骨蛋白多肽粉具有緩解體力疲勞功能。

4 討論

目前運動性疲勞評價方法應用較多的主要有兩種:耐力實驗和生化檢測。機體的耐力以機體連續運動至力竭的時間反映。本實驗選擇小鼠負重游泳實驗，以小鼠力竭游泳時間作為判斷小鼠耐力程度的指標;生化指標選擇有兩類:a.能量物質:肝糖元。b.代謝產物:血乳酸。各指標在運動時變化明顯，而且變化程度與運動負荷強度一致，可作為疲勞的評價指標［17］。驢骨蛋白多肽粉能延長小鼠負重游泳時間，有利于增強機體運動;能提高小鼠肝糖原的含量，有助于提高耐力和運動能力，抵抗疲勞，糖原是運動能量的重要來源，糖原的儲存量可以直接影響機體的運動能力，肝糖原含量直接反映機體糖原代謝情況;能降低運動后的血乳酸含量，可進一步增強抵抗疲勞，血乳酸作為肌肉活動的主要代謝產物，持續運動后血乳酸的數值越低，表明疲勞消除越快。

本實驗的研究結果:驢骨蛋白多肽粉能夠增強小鼠機體抗疲勞功能。可為驢骨蛋白后期的開發與利用提供科學的理論依據，有很好的深加工前景，有待進一步的研究。

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Study on antifatigue effects of donkey bone peptide in mice

MIAO Fu-jun，XIONG Zhi*，WU Ben-hang，DONG Ji-wen，SUN Hao，LI Biao，KANG Liu
(Southwest Forestry University，Key Laboratory for Forest Resources Conservation and Use in the Southwest Mountains of China，Ministry of Education，Kunming 650224，China)

To study the anti-fatigue function of the donkey bone peptide on mice that was significant to study of fully excavating bone protein resources and developing the deep processed products.The weight，loading swimming time，the content of blood lactic acid and liver glycogen of the experimental mice were measured after 30 days through being given different doses of the donkey bone peptide to mice.The result showed the donkey bone peptide could have no obvious impact on the weight and significantly prolong swimming time，increased the reserves of liver glycogen，and decreased the content of blood lactic acid，which indicated the peptide of donkey bone has anti-fatigue function and that would provide a theoretical basis for excavating bone protein resources.

donkey bone;peptide;anti-fatigue

TS201.4

A

1002-0306(2011)11-0411-03

我國是世界上養豬、羊、驢、禽最多的國家，驢肉產量位居世界第一，每年有大量的驢骨產生［1-2］。而且目前，云南楚雄州驢生物產業開發建設項目已經啟動，未來的幾年內，毛驢養殖規模將達66萬頭以上。驢全身都是寶，開發利用價值很大，驢皮具有很高的醫藥價值，是制作“國藥瑰寶—阿膠”的主要原料，而驢骨與驢皮含有相同的骨膠原蛋白［3］，但這些骨骼除部分以骨粉等初級加工形式利用外，往往都被廢棄，致使大量寶貴營養資源流失并導致嚴重的環境污染［4］。利用酶解技術將骨蛋白水解成多肽，而多肽與蛋白質和氨基酸相比具有更多優點:多肽在腸道中的吸收率高于蛋白質和氨基酸［5］;多肽具有促進脂質代謝、降低膽固醇、促進礦物質吸收、促進機體免疫等生理功能［6-8］;多肽具有較好的酸、熱穩定性，水溶性，而且具有良好的抗疲勞活性［9］。國內外研究者尤其是運動學家們越來越重視天然補益性抗疲勞藥物或食品的研究，為提高運動員運動耐力，延緩疲勞發生，加快疲勞恢復，目前已研制出許多抗疲勞制品［10］。但有關驢骨蛋白的抗疲勞作用研究目前尚未見報道。故本研究以新鮮驢腿骨為實驗原料，采用食品級木瓜蛋白酶水解制備驢骨蛋白多肽粉，對其進行小鼠抗疲勞研究，為充分挖掘骨蛋白資源及開發骨蛋白深加工產品提供理論依據。

2010-10-15 *通訊聯系人

繆福俊(1986-)，男，碩士研究生，研究方向:植物生物技術。

云南省教育廳基金項目(09J0066)。