HPLC法同時測定痰熱清注射液中木犀草苷和黃芩苷的含量Δ

姚文冰（廣西北海食品藥品檢驗所，北海市 536000）

痰熱清注射液是國家中藥二類新藥，由金銀花、黃芩、連翹等5味藥材經提取加工制成，具有抑菌、抗病毒等功效[1]，主要用于小兒上呼吸道感染和急性肺炎的防治。目前，未見同一色譜條件下檢測金銀花和黃芩含量方法的文獻報道，故筆者通過相應的方法學考察建立了以高效液相色譜（HPLC）法同時測定痰熱清注射液中木犀草苷、黃芩苷2個指標性成分含量的方法。結果表明，所建方法簡單、快速、準確，可有效用于痰熱清注射液的質量控制。

1 儀器與試藥

1200型HPLC儀（美國Agilent公司）；CP225D型電子天平（德國Sartorius公司）；AW-120型電子天平（西班牙COBOS公司）；SB3200S超聲波清洗器（必能信超聲（上海）有限公司，功率：250 W，頻率：40 kHz）。

木犀草苷、黃芩苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號分別為110795-200806、110715-200514）；痰熱清注射液（上海市某廠，批號：20101214、20100711、20100121）；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-phenyl（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.5%冰醋酸（B），梯度洗脫（0→30 min，10%A→70%A；30→40 min，70%A→30%A；40→45 min，30%A→10%A）；檢測波長：350 nm；流速：0.8 mL·min-1；柱溫：室溫；進樣量：供試品30μL、對照品10μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品貯備液 精密稱取經五氧化二磷減壓干燥12 h以上的木犀草苷、黃芩苷對照品各適量，加入50%甲醇制成木犀草苷和黃芩苷濃度分別為40.92、19.72μg·mL-1的混合對照品貯備液，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密量取樣品20 mL，置分液漏斗中，用乙酸乙酯提取5次，每次25 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣用50%甲醇使溶解并轉移至5 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 分別取按處方工藝制備的不含金銀花、黃芩的陰性樣品，照“2.2.2”項下方法制得陰性對照溶液。

2.3 專屬性考察

分別吸取上述混合對照品貯備液10μL，供試品溶液、陰性對照溶液各30μL，按“2.1”項下色譜條件進樣檢測。結果，供試品溶液中木犀草苷、黃芩苷與雜質峰完全分離，陰性對照無干擾。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.混合對照品；B.供試品；C.陰性對照；1.木犀草苷；2.黃芩苷Fig1 HPLC chromatorgramsA.mixed reference substance；B.test sample；C.negative control；1.luteolin；2.baicalin

2.4 線性關系考察

取上述混合對照品貯備液適量，加50%甲醇制成木犀草苷、黃芩苷濃度分別為0.16、0.79μg·mL-1的混合對照品溶液，依次自動進樣5、10、15、20、25 μL，記錄峰面積。以峰面積積分值（Y）對進樣量（X，μg）進行線性回歸，得木犀草苷的回歸方程為Y＝38.786X+0.2（r＝0.999 3，n＝5），線性范圍為0.82～4.09μg；黃芩苷的回歸方程為Y＝104.59X－54.037（r＝0.999 6，n＝5），線性范圍為2.37～19.72 μg。

2.5 精密度試驗

精密吸取混合對照品貯備液10μL，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積。結果，木犀草苷、黃芩苷的RSD分別為0.20%、0.92%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗

精密吸取同一供試品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件于室溫下0、2、4、6、8、12、24 h各進樣30 μL，記錄峰面積。結果，木犀草苷、黃芩苷的RSD分別為1.24%、0.56%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內基本穩定。

2.7 重復性試驗

取痰熱清注射液（批號：20100711）適量，按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，分別進樣測定。結果，木犀草苷、黃芩苷的平均含量分別為1.87、8.25μg·mL-1，RSD分別為1.46%、0.21%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密量取已知含量的樣品（批號：20100711）10 mL，加入適量的木犀草苷、黃芩苷對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，計算加樣回收率，結果見表1。

2.9 樣品含量測定

取3批痰熱清注射液適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定樣品含量，結果見表2。

3 討論

表1 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 1Results of recovery tests（n＝6）

表2 樣品含量測定結果（μg·mL-1，n＝3）Tab2 Results of content determination of samples（μg·mL-1，n＝3）

3.1 檢測波長的選擇

黃芩苷在276 nm和318 nm波長處均有最大吸收，而木犀草苷在350 nm波長處有最大吸收，為了便于檢測，選擇350 nm為檢測波長[2]。在此波長下檢測，2種成分均有較大的響應，重復性好。

3.2 流動相的選擇

試驗中發現，選擇甲醇-水作流動相時，混合壓力明顯增高；而選擇乙腈-水作流動相時，乙腈的洗脫能力強，且黏度較小，柱壓大小比較合適，但所得峰容易拖尾。后將乙腈-水換成乙腈-冰醋酸，所得的峰拖尾減少。再對冰醋酸的濃度進行調節（0.1%～1.0%），經過比較發現，文中所采用的色譜條件分離效果好，保留時間適宜。

3.3 提取方法的選擇

試用2010年版《中國藥典》（一部）HPLC法測定金銀花中綠原酸和木犀草苷含量對樣品的處理方法[3]，加50%甲醇與70%乙醇稀釋樣品，超聲20 min及采用中性氧化鋁洗脫[3]，分離效果均不理想。故選擇用乙酸乙酯提取，殘渣用50%甲醇溶解的提取方法[3]。該法制備的供試品溶液所得峰形、出峰時間及分離度均可達到較好效果。

[1]高益民，王忠山.對痰熱清注射液臨床藥學初步評價[J].首都醫藥，2004，11（12）：44.

[2]陳福超，李 鵬，方寶霞.HPLC法測定苦碟子注射液中木犀草素的含量[J].中國藥師，2010，13（2）：220.

[3]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（一部）[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：205-206、159、758-759.