早期氣道接觸細菌抗原對Th1/Th2平衡的影響

馮艷青 劉泉

支氣管哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，發病過程涉及淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞等多種炎性細胞以及多種細胞因子，發病率呈逐年上升趨勢。但其發病機制尚不完全清楚，有研究發現，CD+4T細胞(Th)兩種亞型Th1、Th2功能失衡在哮喘發病過程中占據重要地位［1］。為探討哮喘的免疫學發病機制，本實驗設計在大鼠出生早期于鼻咽部給予不同濃度的滅活肺炎鏈球菌及流感嗜血桿菌混合液，大鼠飼養至成年后造模，檢測動物血清中白介素-4(IL-4)、干擾素-γ(IFN-γ)的水平。

1 材料與方法

1．1 實驗動物 健康SD孕鼠4只(北京維通利華實驗動物技術有限公司提供);體重240～270 g，8周齡，動物使用許可證號:SCXK(京):2006-0005，所產幼鼠供實驗用。

1．2 試劑與儀器 卵蛋白(OVA，Sigma公司);百日咳桿菌菌苗(4．7×1010/ml，北京生物制品研究所);肺炎鏈球菌［23F型，昌平疾病預防控制中心(CDC)傳染病所］;流感嗜血桿菌(乙型，昌平CDC傳染病所);超聲霧化器(德國百瑞公司);IL-4試劑盒(尚柏生物醫學技術有限公司)、IFN-γ試劑盒(尚柏生物醫學技術有限公司);自制霧化吸入箱(30 cm×40 cm×50 cm)。

1．3 方法

1．3．1 細菌滅活:將菌種進行傳代及培養后，用VITEK比濁儀測定細菌濃度，用終濃度為0．5% ～1%的甲醛溶液滅菌，涂碟確定無活菌后置于－80℃冰箱保存備用。

1．3．2 出生后細菌抗原接種:幼鼠40只，不分雌雄，隨機分為5 組:即107、106、105細菌抗原組(A，B，C 組)、哮喘組(D 組)、對照組(E組)，每組8只。細菌抗原組大鼠于出生后第1、3、5、7天分別于鼻咽部給予107、106、105滅活肺炎鏈球菌及流感嗜血桿菌混合液10 μl，哮喘組和對照組則給予 PBS 10 μl。

1．3．3 哮喘模型制備:大鼠飼養至成年(約6 周齡)，A、B、C、D組大鼠分別于雙側鼠蹊部皮下注射卵蛋白(OVA)(Ggrade V)和氫氧化鋁凝膠混懸液共1 ml(含 OVA 1 mg和氫氧化鋁50 mg)，同時腹腔注射百日咳桿菌菌苗(5×109/ml)1 ml致敏，2周后，將大鼠置于自制半透明霧化吸入箱中，用2%OVA(GradeⅡ)霧化吸入激發，30 min/次，連續 7 d，30 min/組大鼠則于雙側鼠蹊部皮下注射氫氧化鋁凝膠混懸液1氫氧化鋁50 mg)，同時腹腔注射0．9%氯化鈉溶液1 ml致敏，2周后，使用0．9%氯化鈉溶液霧化吸入激發。最后一次激發24 h內采集標本。腹主動脈取血，分離血清，－80℃冰箱保存備用。

1．3．4 血清 IL-4 和 IFN-γ 測定:采用 ELISA 法，IL-4、IFN-γ 的檢測按試劑盒說明進行。

1．4統計學分析應用SPSS 17．0統計軟件，計量資料以±s表示，采用單因素方差分析方法，組間兩兩比較方差齊時采用方差分析最小顯著法，如方差不齊，則采用近似方差分析Tamhane’s T2方法，P ＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

A、B組大鼠血清中IFN-γ水平與D、E組比較明顯下降，差異有統計學意義(P ＜0．05)。見表1。

表15組大鼠血清IL-4和IFN-γ水平比較n=8，±s

表15組大鼠血清IL-4和IFN-γ水平比較n=8，±s

注:與 A 組比較，*P ＜0．01，#P ＜0．01;與 B 組比較，△P ＜0．05，☆P ＜0．01;與 C 組比較，▲P ＜0．05

組別 IL-4(pg/ml) IFN-γ(pg/ml)A組(n=8)26 ±20 11．9 ±2．7 B 組(n=8) 24±4 13．6±4．0 C 組(n=8) 27±11 20．5±4．3 D 組(n=8) 26±9 24．2±8．4＊△E 組(n=8) 20±7 30．6±9．0#☆▲

3 討論

支氣管哮喘是世界范圍內的常見病，影響著全球約3億人的健康［1］，發病率呈逐年上升趨勢［2］。關于哮喘發病內在機制的研究發現，CD+4T細胞(Th)兩種亞型輔助性T淋巴細胞1(Th1)、輔助性T淋巴細胞2(Th2)功能失衡是哮喘發病的重要機制［3，4］。IFN-γ 和 IL-4分別是 Th1和 Th2細胞的特征性細胞因子，通過檢測這兩種細胞因子可以了解Th1細胞和Th2細胞的功能狀態［5］。駱文玲等［6］給新生SD大鼠皮下注射OVA，大鼠成年后檢測其血清中IFN-γ和IL-4，發現哮喘組大鼠血清中IL-4明顯高于正常對照組，而IFN-γ則顯著下降。李光等［7］給Wistar大鼠腹腔注射OVA，激發后檢測哮喘組動物脾單個核細胞培養上清中IL-4水平明顯高于正常對照組，而IFN-γ則顯著實驗結果顯示，D組大鼠血清而IFN-γ下降，存在Th2 h1/Th2失衡;早期接觸細菌抗原的大鼠，血清IFN-γ水平明顯下降，而 IL-4與 D組接近，使 Th1/Th2失衡更為明顯［8］。

1 李明華，殷凱生，蔡映云主編．哮喘病學．第2版．北京:人民衛生出版社，2005．33-566．

2 Bonini S．The hygiene hypothesis:epidemiologic evidence．J Pediatr Gastroenterol Nutr，2005，40(suppl 1):37-38．

3 拉杰．哮喘發病機理及Th1/Th2比例的關系．天津醫科大學學報，2002，8:403-406．

4 Renz H，Blumer N，Virnas S，et al．The immunological basis of the hygiene hypothesis．Chem Immunol Allergy，2006，91:30-48．

5 Fang SP，Tanaka T，Tago F，et al．Immunomodulatory effects of gyokuheifusan on IFN-gamma/Il-4(Th1/Th2)balance in ovalbumin(OVA)-induced asthma model mice．Biol Pharm Bull，2005，28:829-833．

6 駱文玲，李海潮，郝洪軍，等．早期接觸過敏原對大鼠哮喘模型的影響．北京大學學報(醫學版)，2006，38:159-163．

7 李光，趙育瑩，曲書強，等．支氣管哮喘模型大鼠IL-4 IL-10 IFN-γ的檢測．中國當代兒科雜志，2004，6:474-476．

8 孟文霞，劉艷梅，李曉鸞，等．不同變應對上下氣道變應性疾病的影響．河北醫藥，2010，32:824-825．