脫細(xì)胞雞肌腱的制備與體外生物力學(xué)測定的實驗研究

胡成棟 劉曦 張伯勛 周玉軍 陳懷志 李東風(fēng) 王飛

同種異體肌腱較自體肌腱來源廣泛，是目前肌腱替代品的主要來源。常用的凍干肌腱制作保存較方便，但細(xì)胞外結(jié)構(gòu)破壞明顯，而低溫冷凍肌腱操作較為復(fù)雜、費時，冷凍過程中形成大量冰晶，致使所保存的肌腱活性較低，同時兩者均存在一定程度的免疫排斥反應(yīng)，而肌腱脫細(xì)胞處理在明顯降低免疫原性的同時，較好的保留了肌腱的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)，本文探索同種異體肌腱脫細(xì)胞處理的可行性。

1 材料與方法

1．1 設(shè)計 以來亨雞屈趾深肌腱為研究對象，首先應(yīng)用正交設(shè)計法篩選適于進(jìn)行肌腱脫細(xì)胞保存的化學(xué)方法，并應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)予以判定，隨后將脫細(xì)胞肌腱進(jìn)行生物力學(xué)測定，并采用單盲法與正常肌腱進(jìn)行隨機對照的驗證性研究。所有實驗人員均接受過培訓(xùn)。

1．2 材料 3～4個月齡來亨雞18只，雌雄不拘，體重2．0 kg左右(由解放軍總醫(yī)院實驗動物中心提供，普通級)，隨機分為2組:以脫細(xì)胞處理的雞屈趾深肌腱為實驗組，以新鮮雞屈趾深肌腱為對照組，每組9只。

1．3 方法

1．3．1 切取標(biāo)本:來亨雞俯臥位固定，雙下肢外展，常規(guī)消毒鋪巾，以1%利多卡因進(jìn)行局部趾神經(jīng)阻滯，取雙側(cè)第1趾掌側(cè)正中切口，長約6 cm，切開皮膚及皮下組織，顯露屈趾肌腱鞘，游離并切取屈趾深肌腱，將脫細(xì)胞組肌腱置入D-Hank’s液，于－10℃冷凍24 h后備用，新鮮組肌腱于實驗前切取應(yīng)用。

1．3．2 脫細(xì)胞肌腱的制備:主要以Courtman等［1］提出的方法為基礎(chǔ)完成。①將凍存的左側(cè)第1趾屈肌腱取出，37℃水浴復(fù)溫，反復(fù)凍融3次。②將復(fù)溫的雞屈肌腱然后將肌腱置于37℃、5%CO2的環(huán)境下，經(jīng)過0．25%胰蛋白酶 +0．01%EDTA作用12 h。③將胰蛋白酶消化后的肌腱應(yīng)用D-Hank’s液反復(fù)漂洗后，放入1%Triton-X100(D-Hank’s為溶劑)溶液中，在25℃、5%CO2的環(huán)境下，水浴振蕩(150 r/min)的條件下作用120 h。④再將屈肌腱以無菌蒸餾水持續(xù)沖洗48 h。完成了脫細(xì)胞肌腱的制備。

1．3．3 脫細(xì)胞肌腱形態(tài)學(xué)觀察:分別將新鮮肌腱與脫細(xì)胞肌腱，以10%甲醛固定，常規(guī)脫水、包埋、切片，蘇木素-伊紅(HE)染色及Masson三色染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察。將新鮮肌腱與脫細(xì)胞肌腱制成超薄切片，于透射電鏡下觀察肌腱的超微結(jié)構(gòu)。

1．3．4 羥脯氨酸(Hyp)含量測定:應(yīng)用堿解比色法［2］，配制標(biāo)準(zhǔn)羥脯氨酸溶液，制備羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后將2組肌腱(n=6)切成長20 mm腱段，進(jìn)行體外冷干、稱重、研磨、超聲破碎、高壓水解、加氯氨-T及Ehrlich’s試劑顯色、分光光度計檢測及計算。

1．3．5 2組肌腱間力學(xué)性能比較:將肌腱(n=6)分別固定于生物力學(xué)試驗機上，進(jìn)行滯后環(huán)、應(yīng)力松弛試驗、破壞試肌腱驗測定，并測定的肌腱截面積(將破裂肌腱應(yīng)用10%甲醛預(yù)固定，在破裂肌腱斷端鄰接處，截取厚約0．5 mm肌腱，于低倍鏡下測量肌腱橫斷面的長軸與橫軸，并應(yīng)用數(shù)碼相機記錄，然后應(yīng)用Image-Pro Plus 6．0圖像分析軟件計算橫斷面的面積)，計算肌腱的殘余載荷比(%)、破裂伸長率(%)、彈性模量與破裂強度。

1．4統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 12．0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，采用t檢驗，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 大體觀察 實驗組肌腱為乳白色長索狀組織，表面光滑，彈性韌性良好。但對照組肌腱形態(tài)稍顯松弛。

2．2 光鏡觀察 實驗組可見粗大的膠原纖維沿縱軸平行分布，排列規(guī)整，相互間有交叉，可見沿膠原纖維周圍呈串珠狀縱向分布的肌腱細(xì)胞，核呈橢圓形，橫切面顯示，斷面呈網(wǎng)格狀，多根膠原纖維連接較緊密呈束狀，周圍有完整的結(jié)締組織包繞。試驗組無肌腱細(xì)胞，膠原纖維排列規(guī)整，橫切面顯示膠原纖維周圍包繞的結(jié)締組織較疏松，余與對照組基本一致。

2．3 透射電鏡觀察 對照組肌腱內(nèi)膠原原纖維排列規(guī)整，多呈波浪狀，纖維間相互交聯(lián)，纖維上有明暗交替的周期性橫紋，肌腱細(xì)胞數(shù)量少，分布于膠原原纖維間，肌腱細(xì)胞有多個樹狀突起與膠原原纖維緊密相連，肌腱細(xì)胞內(nèi)胞核為1個，體積較大，核旁可見線粒體和大量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，內(nèi)含絮狀物質(zhì)。實驗組內(nèi)無肌腱細(xì)胞，膠原原纖維排列較規(guī)整，但較新鮮組松散。

2．4 Hyp含量測定 實驗組Hyp含量為(69±6)mg/g，對照組為(68±6)mg/g，2組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0．18，P ＞0．05)。

2．5 肌腱生物力學(xué)性能測定

2．5．1 滯后環(huán):2組肌腱均存在滯后環(huán)。

2．5．2 應(yīng)力松弛試驗:肌腱臨界載荷與峰值載荷的比值為殘余載荷比，此比值反映肌腱應(yīng)力松弛幅度之間的差別。2組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05)。見表1。

2．5．3 破壞試驗:2組間破裂伸長率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05)。

2．5．4 2組肌腱力學(xué)性能比較:在肌腱的應(yīng)力-應(yīng)變曲線的第二段(線區(qū))內(nèi)，其彈性模量保持基本不變。2組間的彈性模量與破裂強度差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05)。見表1。

表12組肌腱相關(guān)生物力學(xué)性能比較n=9，±s

表12組肌腱相關(guān)生物力學(xué)性能比較n=9，±s

組別 殘余載荷比(%)破裂伸長率(%)彈性模量(GPa)破裂強度(MPa)81 ±5 18 ±1．6 1．47 ±0．18 160 ±19 76 ±5 20．0 ±2．2 1．34 ±0．12 172 ±17實驗組對照組

3 討論

對肌腱脫細(xì)胞處理的主要目的在于減少免疫原性的同時，較好的保持肌腱基本結(jié)構(gòu)與力學(xué)性能，能夠為肌腱及髕腱的修復(fù)提供移植物，為組織工程化肌腱提供細(xì)胞外基質(zhì)。

3．1 肌腱脫細(xì)胞處理的原理 研究發(fā)現(xiàn)，同種異體肌腱是一種“結(jié)構(gòu)性”移植，植入的肌腱只起到“生長支架”的作用，肌腱膠原纖維不表達(dá)免疫原性，肌腱細(xì)胞及抗原呈遞細(xì)胞 (APC)是產(chǎn)生免疫排斥的主要來源［3－5］。因此，應(yīng)用化學(xué)法對同種異體肌腱進(jìn)行脫細(xì)胞處理后，將有效降低肌腱的免疫原性，同時保留肌腱的膠原纖維結(jié)構(gòu)，為滑膜外肌腱及跟腱、髕腱缺損提供了新的移植材料。

合格的脫細(xì)胞肌腱應(yīng)該達(dá)到以下標(biāo)準(zhǔn):(1)去除異體肌腱的免疫原性;(2)保留肌腱的膠原結(jié)構(gòu)成分;(3)保持肌腱的生物力學(xué)特性。常規(guī)脫細(xì)胞的物質(zhì)有2種［6，7］:(1)去垢劑:去垢劑是一類可溶于水的脂類，能夠裂解脂膜，溶解抗原，清除免疫復(fù)合物。去垢劑分為:①離子型:包括SDS、LiDS、膽酸鈉、脫氧膽酸鈉等。其缺點是使蛋白質(zhì)高度變性，并使蛋白質(zhì)以單體形式分離。②非離子型:包括 Triton-X 100、Triton-X 114、NP-40、辛葡糖苷等。對蛋白質(zhì)的干擾及蛋白質(zhì)變性的作用較弱。③兩性型:包括CHAPS、Zwitterget等。(2)消化酶:應(yīng)用胰蛋白酶、脫氧核糖核酸酶和核糖核酸酶等作為脫細(xì)胞劑。我們根據(jù)肌腱組織的結(jié)構(gòu)特點，通過預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用胰蛋白酶、Triton-X 100能夠較好的達(dá)到實驗要求。

3．2 2組肌腱形態(tài)結(jié)構(gòu)比較 本實驗中，在光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，脫細(xì)胞肌腱內(nèi)無肌腱細(xì)胞，而膠原纖維排列稍欠規(guī)整，膠原纖維間隙較新鮮組稍寬，出現(xiàn)這種結(jié)構(gòu)的差別的原因，可能在于非離子型去垢劑及消化酶在完成脫細(xì)胞過程中，對于膠原結(jié)構(gòu)稍有影響，而這種差別在電鏡下較為明顯，表現(xiàn)為膠原原纖維間的間隙增寬，排列較紊亂。總之，肌腱經(jīng)脫細(xì)胞處理后，肌腱細(xì)胞去除較為徹底，細(xì)胞外結(jié)構(gòu)獲得較好的保存。

3．3 2組肌腱Hyp測定比較 Hyp是膠原蛋白中的特征性氨基酸，約占膠原總量的10%，主要參與膠原分子間的交聯(lián)，是膠原分子兩股螺旋空間構(gòu)象的一級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)［8］。通過測量肌腱中的Hyp含量可以了解脫細(xì)胞處理是否會對肌腱內(nèi)成分產(chǎn)生影響。本實驗應(yīng)用堿解比色法來測定Hyp結(jié)果顯示2組肌腱的Hyp含量無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05)。因此，可以認(rèn)為脫細(xì)胞處理對肌腱的膠原含量無明顯影響。

3．4 2組肌腱生物力學(xué)性能比較 在本實驗中，通過體外單軸縱向拉伸試驗，探討脫細(xì)胞處理對肌腱力學(xué)性能的影響，結(jié)果顯示脫細(xì)胞肌腱保留了肌腱作為粘彈體的力學(xué)特征，存在滯后環(huán)和應(yīng)力松弛現(xiàn)象，2組肌腱間的殘余載荷比無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05)。在破裂實驗中，2組肌腱的應(yīng)力-應(yīng)變曲線形態(tài)基本一致，在曲線的第二段內(nèi)，應(yīng)力-應(yīng)變線性關(guān)系明顯，其彈性模量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05)。肌腱的破裂伸長率反映膠原纖維的極限伸展情況，結(jié)果顯示，2組肌腱破裂伸長率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0．05)。

在軟組織的生物力學(xué)測試中，軟組織截面積的準(zhǔn)確測算非常困難，在本實驗中，嘗試應(yīng)用了物理測距法、石蠟切片法、冰凍切片法等方法，發(fā)現(xiàn)結(jié)果誤差均較大。最終選擇應(yīng)用10%甲醛預(yù)固定，以增加其硬度及脆性，低倍鏡下測量截面的長、短徑，圖像分析軟件下測量截面積的方法，獲得較為準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)，為生物力學(xué)計算提供良好的基礎(chǔ)。

總之，經(jīng)過脫細(xì)胞處理處理，在去除肌腱細(xì)胞的同時，肌腱細(xì)胞外膠原結(jié)構(gòu)及力學(xué)性能均得以較好保留。

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