獼猴肝臟實驗感染豬囊尾蚴的觀察*

陳崢宏,劉 峰,包懷恩,吳曉娟,楊婷秀

2.貴州省人民醫院,貴陽 550004

豬囊蟲病是由于家豬食入鏈狀帶絳蟲的蟲卵,蟲卵中幼蟲在消化液作用下逸出,移行并在皮下、肌肉和腦組織等組織器官內發育為囊尾蚴而引起,人也可因食入蟲卵而發生囊蟲病。囊蟲病呈世界性分布,我國的流行和分布也相當廣泛,遍及全國。雖然豬囊尾蚴可寄生在中間宿主的肌肉、皮下、腦、眼等組織和器官,也包括肝臟[1-2],但往往只有臨床表現明顯的腦型、眼型和嚴重的皮肌型囊尾蚴病由于癲癇發作、視力障礙或皮下可見明顯結節或包塊才會引起人們的重視,肝囊蟲病由于缺乏特異的臨床表現使豬囊尾蚴在人肝臟的寄生和對健康的危害尚未引起人們的關注。本文以鏈狀帶絳蟲蟲卵感染獼猴,觀察獼猴肝功能、肝臟聲像圖特征及病理變化特征,并對獼猴進行血清豬囊尾蚴抗體檢查,為人肝囊尾蚴病的危害評估和臨床診斷提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 標本來源 鏈狀帶絳蟲采自云南省大理白族自治州鳳儀鎮的近期有排絳蟲節片史病人,以檳榔-南瓜子法驅蟲,蟲體用自來水、0.85%生理鹽水漂洗后保存于滅菌的25%甘油水溶液運送至實驗室,經形態學觀察和分子鑒別鑒定為鏈狀帶絳蟲。

1.2 實驗動物 普通級醫學實驗用獼猴,雌性,體重為5.9 kg,重慶碩斯靈長類動物研究有限公司提供,合格證號：SCXR(渝)2008-0001。

1.3 主要試劑 肝功能檢測試劑均為澳斯邦原裝試劑;透明質酸放射免疫分析藥盒,購自北京北方生物技術研究所;考馬斯亮藍蛋白質定量試劑盒,購自南京建成生物工程研究所;辣根過氧化物酶標記兔抗猴IgG,TMB顯色試劑盒,購自北京博奧森生物科技公司;安定,貴州光定制藥,批號 090817;氯胺酮,江蘇恒瑞制藥,批號071005。

1.4 獼猴的感染和B超檢查 獼猴感染前抽取早晨空腹靜脈血分離血清凍存于-20℃備用,經肌肉注射安定(0.2～0.3mg/kg)鎮靜和鹽酸氯胺酮麻醉后(5mg/kg)以PHILIPS IU22型彩色超聲儀,探頭頻率2.5～10.0 MHz,進行肝臟彩超檢查。分別將5×105個鏈狀帶絳蟲的蟲卵加入飼料內喂食獼猴,專用飼料飼養,并每日喂食適量新鮮水果。感染第84 d,抽取空腹靜脈血分離血清備用,麻醉后以同一臺超聲儀和同樣的探頭頻率進行肝臟B超檢查,記錄病灶數目、大小、形態、內部及后方回聲特征,將病變區圖像局部放大,彩色多普勒血流速度量程調至低速血流狀態(3～6cm/s),觀察局部血流,并根據聲像圖特征提示超聲診斷。

1.5 獼猴感染前后部分肝功能指標的檢查 將感染前后的獼猴血清以拜耳1650全自動生化分析儀采用澳斯邦原裝試劑進行谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、膽堿酯酶(CHE)和總膽汁酸鹽(TBA)的檢測;透明質酸(HA)檢測采用固相放射免疫法按藥盒操作說明進行。

1.6 獼猴的剖檢、囊尾蚴的分布及肝病變組織的病原核酸檢測和病理學檢查 于感染第90d以肌肉注射安定(1 mg/kg)和氯胺酮(20mg/kg)麻醉獼猴致死,測量體重,剖檢全身各組織器官,采集囊尾蚴,并立即置于0.5%(mL/mL)膽汁鹽水中,于室溫下孵育至頭節翻出,將翻出頭節的囊尾蚴放置于一滴生理鹽水中,于載玻片上直接用光學顯微鏡觀察后加覆蓋玻片制片鏡檢。仔細檢查獼猴肝組織,取病變組織經10%甲醛固定后進行常規石蠟切片、HE染色鏡檢。

1.7 獼猴血清中豬囊尾蚴抗體的檢查

1.7.1 豬囊尾蚴抗原的制備 將豬帶絳蟲蟲卵實驗感染的家豬肌肉內檢獲的囊尾蚴經PBS洗滌后用玻璃勻漿器勻漿,并用超聲波粉碎儀破碎,經臺式離心機12 000r/min離心15min,取上清濾過除菌后以考馬斯亮藍蛋白定量試劑盒定量,于-20℃保存備用。

1.7.2 血清中豬囊尾蚴抗體的ELISA法檢測 以4.9μ g/mL的豬囊尾蚴抗原包被酶標板孔,每孔100μ L,置4℃包被過夜,洗滌液洗滌各孔,加1/10、1/100、1/200、1/400 的感染前、后獼猴血清各100μ l,每份稀釋血清重復3孔,同時設置 3孔 PBS對照。經37℃孵育1h,洗滌后加1/1 000的辣根過氧化物酶標記兔抗猴IgG各100μ L,37℃孵育1h,以TMB顯色試劑盒按說明書操作顯色和終止后于450nm測量各孔吸光度值。

2 結 果

2.1 獼猴肝臟B超檢查 感染前獼猴肝臟B超檢查未見異常,感染后獼猴肝臟見11個大小較為均一的結節,形態多為類圓形、橢圓形或梭形,邊界一般較清楚,均未見包膜,內部呈不均勻的低回聲或混合性回聲,多數結節壁上有強回聲光斑且后方伴聲影(圖1)。CDFI顯示病灶內均無血流信號,周圍可見正常的動脈、肝靜脈及門靜脈樣血流信號走行。超聲診斷提示：肝臟多發實性結節伴鈣化斑。

圖1 感染鏈狀帶絳蟲囊尾蚴84 d的獼猴肝臟超聲圖Fig.1 Liver ultrasonography of the macaque infected by T.solium larva(arrows showing nodules)

2.2 部分肝功能指標檢測 感染前和感染第84d的獼猴空腹靜脈血中部分酶及透明質酸的檢查結果見表1。

表1 感染前后獼猴的部分肝功能指標Table 1 Indicators of liver function of the monkey before and after infection

2.3 囊尾蚴的分布及肝組織病變的病原檢查和病理學檢查 感染鏈狀帶絳蟲囊尾蚴90天的獼猴體重為3.5kg,在獼猴肌肉內檢獲11個囊尾蚴(圖2),心包膜下檢獲2個囊尾蚴,肝實質內見11個結節,大小為(1.0×1.5)～(1.5×3)mm,其余組織器官未見囊尾蚴和病變。病變組織的石蠟切片HE染色鏡檢顯示,病灶內可見壞死的蟲體,周圍有纖維結締組織包裹伴炎癥細胞浸潤,以嗜酸性粒細胞為主,部分可見淋巴細胞浸潤及肉芽腫,肉芽腫周圍纖維結締組織增生(圖3),可見肝細胞脂肪變性(圖4)和壞死。

圖2 獼猴肌肉內的囊尾蚴Fig.2 Cysticerci from the monkey's muscle

2.4 血清囊尾蚴抗體的ELISA檢測 感染前、后各稀釋血清ELISA檢測的OD450見表2。與PBS對照相比,以大于PBS對照孔OD值2.1倍,即大于0.202為顯色陽性,則感染后血清經400倍稀釋,囊尾蚴抗體仍為陽性,而感染前各稀釋血清囊尾蚴抗體均為陰性。

3 討 論

表2 獼猴感染前、后血清抗體ELISA檢測的OD450(3次實驗結果均值)Table 2 OD450of the ELISAtest on the serum antibody of the monkey before and after infection(mean value of three tests)

肝寄生蟲病在我國許多地區均有流行,多為血吸蟲、肺吸蟲、包蟲及蛔蟲引起肝臟占位性病變的報道。雖然已有研究表明,除了皮膚、肌肉、眼和腦組織,家豬肝臟也是豬帶絳蟲囊尾蚴的重要寄生部位[1-2],但肝囊蟲病對人的危害尚未引起關注。本文以豬帶絳蟲蟲卵感染獼猴的實驗結果表明,豬囊尾蚴也可寄生于獼猴的肝臟。部分肝功能相關血清酶的檢測表明,感染前后獼猴血清ALT、AST數值有所差異,但均在獼猴血清ALT、AST正常值范圍之內[3]。人的肝血清酶學指標中,ALT、AST等僅在急性或重型肝炎患者與健康正常人群表現出顯著的差異性,在慢性肝炎和酒精性肝炎則缺乏診斷價值[4]。TBA則是肝損傷的敏感指標[5-6],它是膽固醇在肝臟中分解的代謝產物,其生成和代謝與肝臟密切相關。在各種肝臟疾病時,肝臟對膽汁酸的重吸收減少,從而導致血清中 TBA的含量增加。因此測定血清中TBA可以直接反映肝臟的攝取、合成及排泄功能。在肝細胞有較輕微損傷時,TBA的升高比其它常規肝功能指標更敏感[5-6]。膽堿酯酶是肝細胞合成的水解酶,隨著肝臟纖維化程度的加重,CHE合成逐漸減少[6]。透明質酸是一種廣泛存在于細胞外基質中的高分子多糖,主要由肝內皮細胞進行降解,慢性肝損傷時,肝間質細胞增殖,HA的合成增加;肝竇內皮細胞受損,攝取分解HA功能降低;并且肝組織纖維化時肝內有不同程度的血流紊亂,門靜脈分流增加,也減少了竇內皮細胞對HA的攝取分解,導致血清HA升高,是反映肝纖維化的重要指標[7]。在健康人群中,TBA值上下波動在均值的54%以內,ChE上下波動在均值的17%以內[5],HA上下波動在均值的46%以內[7]。本實驗中獼猴感染后與感染前相比,TBA增高3.4倍,ChE降低25%,HA增高88%。由于缺乏獼猴血清TBA、ChE和HA正常值的資料,難以根據這三項指標來判斷該獼猴肝臟代償功能是否異常,然而這三項指標的變化提示肝臟ChE合成、對膽汁酸重吸收的減少和對HA攝取分解能力的降低,豬囊尾蚴在獼猴肝臟的寄生已導致肝臟的損傷。

超聲檢查顯示獼猴肝臟病灶多為不均勻低回聲,其壁上有強回聲伴后方聲影,考慮為感染后組織自身修復過程中纖維組織增生,致聲阻抗差增大,從而使回聲增強,并伴后方聲衰減。病灶內CDFI檢查無血流信號,提示肝囊蟲病病變多為少供血的病變。本文的結果表明,超聲顯像有很高的軟組織分辨力,能靈敏地顯示出肝臟占位病變。但是,寄生蟲感染性病灶的聲像圖特征缺乏特異性,需要進行超聲引導下穿刺活檢方能鑒別良惡性病變和肝寄生蟲感染性病變[8],若要確診為何種寄生蟲感染,尚需結合臨床和流行病學資料以及進行相關的病原學、免疫學或分子生物學檢查。本實驗中受染獼猴肝臟的結節周圍可見嗜酸性粒細胞為主的炎性細胞浸潤,可初步診斷為寄生蟲感染。免疫學診斷,即血清囊尾蚴IgG的ELISA檢測亦提示豬囊尾蚴的感染。

盡管肝臟具有較強的代償功能,但囊尾蚴的寄生和引起的炎癥反應已經導致了本實驗中獼猴肝臟的局灶性損傷,并對肝功能造成一定的影響,其危害應引起關注,特別是在豬帶絳蟲和囊蟲病流行區,許多誤食豬帶絳蟲蟲卵或感染豬帶絳蟲成蟲的人由于未出現明顯的神經系統癥狀或皮下未見結節而忽視了感染的存在,農村醫療條件的限制使已經感染了豬囊尾蚴,肝臟已出現病變的患者未能得到及時診斷和治療。本文實驗結果表明,在豬囊蟲病和豬帶絳蟲病流行區,血清豬囊尾蚴抗體檢測結合肝臟B超檢查,有助于發現肝囊蟲病患者。

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