竹鼠肺炎克雷伯氏菌的分離鑒定*

馬 磊,顏其貴,2,萬 莉,張 琦,楊 映,謝智勇

2.四川農業大學動物疫病與人類健康四川省重點實驗室

肺炎克雷伯氏菌(K.peneumoniae)屬于腸桿菌科腸道桿菌屬,廣泛存在于人和動物腸道、呼吸道以及水、土壤、農產品和林產品中。正常情況下,本菌不會引起動物發病,但是當機體抵抗力下降或本菌大量增殖時,就會引起動物發病甚至暴發性流行[1],肺炎克雷伯氏菌被列為條件致病菌,是目前公認的導致動物和人類發病的克雷伯氏菌[2-3]。其可引起支氣管炎、肺炎,泌尿系統和創傷感染,甚至敗血癥、腦膜炎、腹膜炎[3]等。近年來,雖然中國養殖業,尤其是經濟動物養殖業得到了迅猛發展,但由于養殖戶的管理水平、養殖場的硬件和軟件設施不能進行規范化管理等原因,已經有多起由該菌引起的人畜感染的報道,且已日益被關注[4]。

1 材料與方法

2010年10月四川省某竹鼠人工養殖場竹鼠陸續死亡情況,病情無大小、性別差異。典型癥狀為突然起病,有寒戰和咳嗽,甚至出現意識障礙伴躁動不安等嚴重癥狀。剖檢后發現腹腔有大量膠胨樣積液,腸道嚴重臌氣,肺臟有實變和充血,肝臟腫大,腎臟有出血點。累積剖檢瀕死病鼠23只。

酵母浸出物、胰蛋白胨等試劑購自Sigma公司;兔血無菌采自健康家兔;藥敏試紙(批號：090801)及微量生化反應管(批號：20090714)購自杭州微生物試劑有限公司。2×Taq PCR Master Mix、DNA分子量標準、凝膠回收試劑盒等購自北京天根生化科技有限公司;其余試劑均為國產分析純。健康昆明小白鼠購于四川大學華西實驗動物中心 ,共60只 ,規格 19～21g/只。

引物采用擴增細菌16SrDNA的通用引物[5],上、下游引物序列分別為：5′-AGAGT TTGATCCTGGCTCAG-3′和 5′-ACGGCTACCT TGTTACGAC T T-3′。引物由上海英駿生物技術有限公司合成。

無菌條件下分別用接種環醮取肝、肺和腸道內部分別接種LB固體和液體培養基、麥康凱培養基,37℃恒溫箱培養18～24h,同時進行厭氧培養,對分離到的細菌進行純化培養,挑取單個菌落進行革蘭氏染色鏡檢,用5%的兔鮮血平板鑒定溶血性。

將分離純化的細菌接種于細菌理化特性鑒定用培養基中,進行氧化酶、接觸酶、吲哚、糖(醇及苷)類代謝等較系統的理化特性測定,具體方法參照《常見細菌系統鑒定手冊》[6]。

將分離到的細菌純化后,參照文獻[7]中試驗規范進行藥敏試驗,并對照杭州微生物試劑有限公司的藥敏試驗判斷標準來判定結果。

在培養平板上無菌挑取單個菌落直接加入到反應體系中進行菌落PCR擴增,反應體系(50μ L)：2×Taq PCR Master Mix 20μ L,引物各 1.5μ L,超純水 27μ L;反應條件：95℃預變性 10min,95℃循環變性30s,53℃退火復性30s,72℃延伸1min30s,進行30個循環,72℃終延伸 8min,最后4℃保存,反應結束后產物經1%瓊脂糖凝膠電泳,用瓊脂凝膠回收試劑盒將PCR產物回收后,送上海英駿生物技術有限公司測序。

在預試驗的基礎上,用菌落計數法調整菌懸液濃度至 3.6×109、3.6×108、3.6×107、3.6×106、3.6×105CFU/mL共5個稀釋度;采用無菌操作技術,以0.2mL/只的劑量對小白鼠進行腹腔注射,對照組以0.2mL/只的劑量腹腔注射無菌生理鹽水,每組5只,健康小白鼠暫養3d觀察健康后進行致病性試驗;在接種后每隔6h觀察一次,連續觀察14d,記錄實驗動物的臨床表現,對死亡實驗動物進行剖解,觀察并記錄各組織器官的病變;從死亡小白鼠肺臟和腸道中再次分離細菌,并進行鑒定;依改良寇氏法求出半致死劑量(LD50)[8]。

2 結 果

2.1 細菌分離鏡檢 剖檢的病鼠肺和腸道中均有大量細菌,經分離純化后獲得一株優勢菌。該菌株生長的營養要求不高,兼性厭氧,在LB固體培養基形成灰白色黏液狀圓形大菌落,用接種環挑之有絲狀;麥康凱培養基上長成紅色菌落;兔血平板上無溶血現象。革蘭氏染色鏡檢,該菌為短粗、卵圓形G-桿菌,有莢膜,單個或雙個存在。

2.2 生化鑒定 該菌為兼性厭氧發酵型無運動能力的G-桿菌,其理化特性見表1。

2.3 藥敏試驗 表2為藥敏試驗結果,該菌對供試的頭孢美唑等藥物高度敏感,對丁胺卡那霉素等藥物中度敏感,對潔霉素等藥物耐藥。

表1 分離菌的生理生化特征Table 1 Biochemical and physiological characteristics of the strain

2.4 分子生物學鑒定結果 將該株菌進行純化培養后,挑取少量單個菌落進行16SrDNA-PCR擴增(50μ L體系),其產物經1%瓊脂凝膠電泳后結果如圖1所示,該菌株擴增出的16SrDNA的片斷大小約1 500bp。測序后經BLAST分析測序結果表明：該菌株16SrDNA基因部分序列與肺炎克雷伯氏菌(GenBank中的序列注冊號：GU339298)的同源性最高,達99%。

2.5 致病性檢測 該菌株對小白鼠的致病性結果見表3。發病小白鼠出現呼吸困難、腹腔有膠胨樣積液,腸道嚴重臌氣,肺臟有實變和充血,腎臟有出血點等癥狀,與自然發病竹鼠癥狀一致;對照組正常。從死亡小鼠肺臟中再次分離到的菌株經鑒定與試驗菌株一致。該菌株對小白鼠的LD50為4.5×107CFU/只。

圖1 16S rDNA-PCR擴增結果Fig.1 PCR amplif ication of 16S rDNA

3 討 論

本試驗通過對發病竹鼠進行細菌分離,根據培養特性、理化特征和16SrDNA序列分析,判定分離得到的菌株為肺炎克雷伯氏菌。參照相關文獻[9-12],選擇其敏感實驗動物小白鼠對分離菌株進行致病性試驗,確定分離得到菌株為此次竹鼠發病的主要病原菌。該菌能引起竹鼠肺炎、腹膜炎和腸道臌氣等癥狀,其 LD50為4.5×107CFU/只。

表2 藥敏試驗結果Table 2 Drug sensitivity test of the strain

肺炎克雷伯氏菌分布廣泛,最先從大葉性肺炎病人的肺組織中分離到,當機體免疫力降低或長期服用抗生素導致菌群失調時易引起感染,若治療不當則死亡率極高。目前,在人類感染中肺炎克雷伯氏菌是除大腸桿菌外的醫源性感染最重要條件致病菌;在動物感染中各種家畜家禽、野生動物及水生動物都可感染[3,13],并且是實驗動物質量檢測中常被檢出的病原菌[14-15],其已成為倍受關注的人獸共患病病原。到目前為止,還沒有從竹鼠病變組織中分離到該致病菌的報道。

藥敏試驗結果表明,此次得到的該株肺炎克雷伯氏菌對頭孢美唑等高度敏感,對丁胺卡那霉素等中度敏感,對潔霉素等耐藥。建議臨床上選用高敏藥物或中敏藥物加大劑量進行治療用,避免濫用抗生素而引起的病原菌對大量藥物產生耐藥性。廣譜抗菌素的大量使用導致機體正常菌群的失調,會增加肺炎克雷伯氏菌的易感性,故要慎重用藥。據相關資料顯示,各種降低免疫功能的慢性病、腎上腺皮質激素和其他免疫抑制劑的應用和某些創傷性診療技術也會增加肺炎克雷伯氏菌的易感性,是生產過程中不能忽視的問題。本次試驗為竹鼠健康養殖生產和對預防肺炎克雷伯氏菌病提供一定的參考價值。

表3 菌株對小白鼠的致病性(死亡數/試驗數)Table 3 Pathogenicity of the strain to mouse(Death no./test no.)

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