成骨細胞胞內胞外堿性磷酸酶含量比較

張英，袁月，孫富麗

（中國醫科大學附屬口腔醫院綜合急診科，沈陽 1 1 0 0 0 2）

堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）廣泛存在于機體各組織器官中，主要是肝、腎、胎盤、小腸和骨。人體血清中ALP主要由肝臟及成骨細胞合成（幾乎各占50%），分別稱為肝源性及骨源性堿性磷酸酶。ALP是成骨細胞所分泌的一種酶蛋白，是成骨細胞分化的特異性標志，是最常見評價成骨細胞分泌功能的指標之一。所以，ALP的檢測結果對成骨細胞的研究有重要意義。目前檢測ALP的實驗方法很多，文獻中常用的方法可概括分為2類：直接取成骨細胞的培養基進行檢測、將成骨細胞破碎后進行檢測。成骨細胞分泌的ALP是細胞內多還是在細胞外多，對實驗方法的選擇及實驗結果都會造成一定影響。本實驗就此問題進行研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與儀器、試劑

出生24 h的大鼠，雌雄不限，購自中國醫科大學動物實驗中心。主要儀器：超凈工作臺，培養箱，相差顯微鏡，低溫離心機。主要試劑：DMEM培養基（GIBCO公司，美國），胎牛血清（sigma公司），HEPES（AM-RESCO 公司，美國），青／鏈霉素、Ⅰ型膠原酶（Sigma公司，美國），胰蛋白酶（GIBCO公司，美國），ALP染色試劑盒（碧云天公司），Ⅰ型膠原免疫熒光染色試劑盒（abcam公司，美國），ALP含量測定試劑盒（昊柏公司）。

1.2 成骨細胞的分離、接種與傳代

采用酶交替消化法對成骨細胞進行分離［1］。將4只大鼠胎鼠浸泡于75%乙醇中5 min，取出后放入培養皿中，剝出顱骨，放入有雙抗的PBS液中浸泡。移入超凈臺內，用PBS將取下的顱骨沖洗3次。加入0.25%的胰酶，重復3次加入2 mL（1 mg/mL）的Ⅰ型膠原酶交替消化；收集消化液，加入4 mL高糖培養基終止消化。低溫離心機1 000 r/min離心10 min，棄去上清；將沉淀移入培養瓶中，加入5 mL10%高糖培養基；放入37℃5%CO2培養箱中培養1 h后，將培養瓶翻轉過來。以后每3 d換1次培養液，每5~7 d傳代1次。

1.3 成骨細胞鑒定

1.3.1 相差顯微鏡下觀察細胞形態

1.3.2 ALP染色：將培養第4代的成骨細胞在蓋玻片上爬片，多聚甲醛固定30 min。0.01 mol/L PBS洗3次，每次5 min。用碧云天ALP染色試劑盒染色，避光孵育24 h。

1.3.3 Ⅰ型膠原免疫熒光染色：用4%多聚甲醛固定30 min，應用abcam試劑盒染色，避光在熒光顯微鏡下觀察。

1.3.4 茜素紅染色：培養皿用PBS沖洗2次，95%乙醇固定10 min，雙蒸水沖洗3次。0.1%茜素紅-Tris-Hcl（pH 8.3）37℃，30 min。

1.3.5 ALP 含量測定：（1） 將傳代后 1 d、2 d、3 d 的細胞分別設定為第1，2，3組，每組各取5瓶，將每瓶的培養液取出設為對照組；將相同培養瓶瓶底的細胞消化下來，使用超聲波細胞粉碎機將細胞粉碎，設為實驗組。（2）將1 mL反應液R1加到比色杯中，37℃孵育3 min后加入20 μL待測樣品，攪勻并保溫30 s。（3）加入 250 μL 反應液 R2到比色杯中，攪勻并保溫30 s。（4）然后用酶標儀或分光光度計測定405 nm處2 min到10 min內的吸光度變化計算這2個時間點的OD值的差值，計算差值的平均值和標準差。

2 結果

2.1 相差顯微鏡下觀察成骨細胞形態

接種前成骨細胞呈體積均一的圓形細胞，接種24 h后，少量細胞開始貼壁生長，顯微鏡觀察貼壁生長細胞為長梭形或有2~3個突起，胞質透亮、飽滿。部分細胞突起為3~4個，體積較前明顯增大，似星形，顯示出較好的貼壁性，部分區域出現重疊生長以及輻射生長的現象。第2代細胞貼壁后增殖加快，形態以不規則形、長梭形、三角形為主，相鄰細胞彼此貼靠，細胞內及表面開始出現分泌物。見圖1。

2.2 ALP染色結果

細胞均染色呈梭形、多角形，細胞質染色呈深藍色。見圖2。2.3 Ⅰ型膠原免疫熒光染色

細胞均染色呈梭形、多角形，細胞質染色發出紅光。見圖3。

2.3 茜素紅染色

在顯微鏡下觀察，細胞間分泌的鈣結節被染成紅色。見圖4。

2.4 實驗組和對照組ALP含量比較

實驗結果說明：成骨細胞內分泌的ALP比成骨細胞外分泌的ALP高，差異有統計學意義。

分別對細胞內和細胞外的3組數據進行單因素方差分析，P值結果如下表：從表1可以看出：當第1天與第5天、第3天與第5天進行ALP含量比較時，如果將細胞破碎檢測，結果有統計學意義，直接取培養液進行檢測，結果沒有統計學意義。故直接取培養液進行檢測的方法可能降低了差異大小，最終影響實驗結果的準確性。

表1 3組數據組間差異的分析結果（P）T a b.1 T h e a n a l y s i s r e s u l t s o f 3 d a t a g r o u p s（P）

3 討論

ALP是Suzuki等在1907年首先發現的，生理作用是非特異性水解磷酸單酯鍵，最適pH值為8.6~10.3，因此稱為ALP，臨床上長期用作診斷肝、膽和骨組織疾病的實驗室參數之一［2，3］。ALP主要產生于肝臟、骨和胎盤，也可產生于腎和小腸。有4種同工酶，分別為肝、骨、小腸和胎盤型。ALP廣泛存在機于體各組織器官中，主要是肝、腎、胎盤、小腸和骨。ALP活性是很多細胞如成骨細胞、牙周膜細胞、牙髓細胞等的功能及分化程度的指標。在細胞中表達的多少，反映出細胞的分化程度和功能狀態，因此定量檢測細胞內的ALP活性具有非常重要的意義。ALP是成骨細胞所分泌的一種酶蛋白，活性的高表達是成骨細胞分化的特異性標志［4，5］，是最常見評價成骨細胞分泌功能的指標之一。ALP含量可以間接反應成骨細胞的功能，測定血清ALP含量可反映骨代謝活動。

目前，血清中ALP活性的檢測方法已成熟并廣泛應用于臨床。而對體外培養的細胞內ALP活性的檢測卻缺乏統一的標準方法，并且研究較少。目前文獻中關于體外培養細胞內ALP的檢測方法有很多種，可概括分為2類：直接取成骨細胞的培養基進行檢測，將成骨細胞破碎進行檢測。由于各實驗室條件不同，可以將后者分為反復凍融法破碎細胞［6］、使用Triton-X100［7］破碎細胞、使用超聲破碎儀破碎細胞。直接檢測培養基中的ALP這種方法［8］，操作簡便，但成骨細胞內分泌的ALP比細胞外分泌的高，故該實驗方法降低了各比較組之間的差異，外低于內從而從側面影響實驗結果的準確性，如表2。Triton-X100是一種非離子型表面活性劑，對細胞起到打孔的作用，實驗方法簡便［9］，但有化學試劑的參與將會對酶的活性或試劑的反應造成影響，而影響實驗的準確性。反復凍融的方法檢測ALP，屬于物理的方法，沒有化學試劑的參與，避免了對檢測試劑盒的影響，并且該方法操作相對簡單，但在反復凍融過程中容易對ALP的活性造成影響，從而影響了最終結果；本實驗采用超聲破碎儀破碎細胞，選用物理的方法破碎細胞，在破碎同時使用涼水物理降溫，盡量保存ALP的活性，使實驗更加真實、可靠。

故本實驗通過對成骨細胞內、外分泌ALP的檢測方法進行對比研究。結果證明：成骨細胞細胞內分泌的ALP與細胞外分泌的ALP差異有統計學意義，細胞內分泌的ALP高。在分組時，考慮到細胞在體外生長的周期，即可能的ALP分泌的變化。采用傳代后1 d、2 d、3 d，目的是使結果更加可信。并且，實驗組與對照組來自同一瓶細胞，排除了不同原代培養細胞對實驗結果可能造成的影響。

綜上所述，成骨細胞內分泌的ALP比成骨細胞外分泌的ALP高，差異有統計學意義。因此，建議盡量采用將細胞破碎的方法進行ALP含量的檢測，以提高結果的準確性。

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