普羅布考對腎小球硬化大鼠腎組織轉化生長因子β1的影響

蘇雪松，周光宇，杜豐，李德天

（中國醫科大學附屬盛京醫院腎內科，沈陽110004）

腎小球硬化是多種腎臟疾病發展的最終結局，是導致終末期腎病的重要原因，有數據顯示我國終末期腎病的發病率呈上升趨勢，因此抗腎小球硬化的有效治療受到越來越廣泛的關注。腎小球硬化的形成與發展是多因素參與、十分復雜且漸進的過程，它重要的病理特征是腎小球系膜細胞的過度增殖、進行性的細胞外基質沉積、相關細胞因子的作用等，其中轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是調節腎臟炎癥、硬化的最重要的生長因子之一［1］。本研究觀察了普羅布考對阿霉素致腎小球硬化大鼠腎組織TGF-β1的影響，探討其對腎小球硬化動物模型腎臟保護作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑

雄性Wistar大鼠32只，8～10周齡，體質量200～250 g，由中國醫科大學附屬盛京醫院動物實驗中心提供。鹽酸阿霉素，購自深圳萬樂藥業有限公司；普羅布考（商品名之樂），購自齊魯制藥有限公司；TGF-β1兔抗大鼠多克隆抗體、免疫組化染色試劑盒（即用型SABC）、DAB顯色試劑盒，購自武漢博士德公司；其余普通試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 模型的建立、分組及給藥方法：所有大鼠隨機分為3組：對照組（n=8）、模型組（n=12）和普羅布考治療組（n=12）。模型組和治療組大鼠麻醉后行左腎切除術，于術后第7天按5 mg/kg經尾靜脈注射阿霉素，術后第28天按3 mg/kg再次經尾靜脈注射阿霉素。對照組行假手術，術后同期注射等量生理鹽水。治療組大鼠于第1次尾靜脈注射阿霉素后給予普羅布考500 mg·kg-1·d-1灌胃治療，共12周。模型組與對照組予等量生理鹽水灌胃。實驗過程中，模型組大鼠死亡4只，治療組大鼠死亡2只。

1.2.2 尿蛋白及血生化檢查：于第0、4、8和12周末時用代謝籠準確收集24 h尿，尿蛋白測定采用柳氮磺酸比濁法。心臟采血，采用日立7170A自動生化分析儀測定血清肌酐、血尿素氮和血清白蛋白。

1.2.3 腎組織病理學檢查：腎臟標本經10%中性甲醛固定，石蠟包埋，切片厚3 μm，行常規蘇木精—伊紅（HE）和過碘酸—雪夫（PAS）染色后鏡檢。計算腎小球硬化指數（glomerulosclerosis index，GSI）：采用半定量的 RAIJ法［2］按如下公式計算：GSI=［（1×n1）+（2×n2）+（3×n3）+（4×n4）］/每張切片腎小球總數×100。

1.2.4 免疫組織化學檢查：采用SABC法檢測腎組織中的TGF-β1的表達，按試劑盒說明進行操作。以PBS代替一抗作為陰性對照，片中出現棕黃色顆粒為陽性結果。采用Floege半定量法［3］計分：0分，系膜基質染色弱或缺乏；1分，不超過25%的系膜區局部染色加深；2分，26%～50%的系膜區局部染色加深；3分，51%～75%的系膜區局部染色加深；4分，75%以上系膜區染色加深，每張切片計數20個腎小球積分，取均值。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠尿蛋白排泄量的變化

模型組和治療組尿蛋白排泄量增加，在第4、8、12周時與對照組比較差異均有統計學意義（P<0.05），治療組尿蛋白排泄量在各觀察時點均較模型組明顯減少（P<0.05），見表1。

2.2 各組大鼠血清肌酐、血尿素氮及血清白蛋白水平的比較

模型組與對照組相比，血清肌酐、尿素氮均升高，而血清白蛋白顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.05）。治療組與模型組比較，血白蛋白升高，血清肌酐、尿素氮下降（P<0.05），提示腎功能得到改善，但仍重于對照組（P<0.05），見表1。

2.3 腎組織普通病理

光鏡下對照組無明顯病理改變；模型組腎小球系膜基質中度至重度增生并呈彌漫性分布，呈現腎小球節段性硬化，小部分腎小球呈球形硬化，可見球囊粘連，囊壁中度增厚，毛細血管襻部分閉塞，部分代償性擴張，間質纖維化，有炎性細胞浸潤，小管灶性擴張，蛋白管型多見；治療組上述病理改變明顯減輕（圖1）。模型組、治療組及對照組的GSI分別為139.56±31.23，81.78±24.73 和18.01±6.12，表明治療組腎小球硬化程度比模型組明顯減輕，差異有統計學意義（P<0.05），但仍重于對照組（P<0.05）。

2.4 腎小球TGF-β1的表達

對照組大鼠TGF-β1在腎小球表達極少甚至不表達；模型組和治療組的腎小球TGF-β1表達均明顯增強（圖2）。模型組、治療組和對照組的Floege評分分別為3.18±0.47，2.54±0.61 和1.62±0.24。半定量分析結果顯示，與對照組比較，模型組和治療組TGF-β1的表達明顯增高（P<0.05），而治療組 TGF-β1的表達比模型組明顯減弱，差異有統計學意義（P<0.05）。

3 討論

本實驗采用單側腎切除加重復注射阿霉素的方法建立腎小球硬化大鼠模型，該方法腎小球硬化率較高，重復性和穩定性好，目前被認為是研究慢性腎功能不全比較成熟的動物模型［4］。實驗結果證實，造模大鼠表現為大量蛋白尿、低白蛋白血癥和腎功能惡化，且腎臟組織學改變為腎小球系膜細胞和基質增生、腎小球節段性硬化、間質纖維化、蛋白管型多見，說明復制阿霉素腎硬化模型是成功的。

腎纖維化是絕大多數腎小球疾病進展至后期的一種共同的組織學改變，TGF-β1在腎纖維化中的作用涉及到細胞外基質、細胞增殖及轉分化、炎性浸潤等各個環節，是介導腎小球硬化和腎間質纖維化的關鍵細胞因子。普羅布考具有調脂、抗氧化、穩定動脈粥樣硬化斑塊、改善內皮功能等作用，是目前有效的抗動脈粥樣硬化藥物之一，而且其在防治糖尿病及其并發癥、改善肝功能等方面的作用日漸凸現［5，6］。最近的研究還發現，它在內膜細胞和大鼠系膜細胞具有抗增殖作用［7，8］。已有研究表明，普羅布考能夠通過抑制JAK2/STAT途徑的活化，減低TGF-β1和結締組織生長因子等細胞因子的表達，從而減少高糖誘導的人腎小球系膜細胞細胞外基質積聚［9］。本研究結果顯示，在阿霉素致腎小球硬化大鼠模型中，TGF-β1的表達明顯增加，與對照組比較差異有統計學意義（P<0.05），跟 Zhou 等［10］的報道相似，這提示腎小球TGF-β1表達異常增高是導致阿霉素腎小球硬化大鼠腎小球病理損害的機制之一，普羅布考治療組大鼠TGF-β1的表達明顯低于模型組（P<0.05），這與文獻報道［11］相似。

本實驗觀察到普羅布考可降低阿霉素腎硬化大鼠腎小球TGF-β1的表達，減少尿蛋白排泄量，改善腎功能，減輕腎組織病理損傷，這提示普羅布考對大鼠腎小球硬化的防治作用可能與其抑制TGF-β1的表達有關，但該藥延緩腎小球硬化的其他機制仍待進一步探討。

［1］Prud’homme GJ.Pathobiology of transforming growth factor beta in cancer，fibrosis and immunologic disease，and therapeutic considerations［J］.Lab Invest，2007，87（11）：1077-1091.

［2］Raij L，Azar S，Keane W.Mesangial immune injury，hypertension，and progressive glomerular damage in Dahl rats ［J］.Kidney Int，1984，26（2）：137-143.

［3］Floege J，Alpers C，Burns MW，et al.Glomerular cells，extracellular matrix accumulation，and the development of glomerulosclerosis in the remnant kidney［J］.Lab Invest，1992，66（4）：485-497.

［4］王泰華，錢家麒.阿霉素腎病腎硬化動物模型的實驗改進［J］.腎臟病與透析腎移植雜志，1997，6（2）：191-193.

［5］Endo K，Miyashita Y，Sasaki H，et al.Probucol delays progression of diabetic nephropathy ［J］.Diabetes Res Clin Pract，2006，71（2）：156-163.

［6］Tokushige K，Hashimoto E，Yatsuji S，et al.Combined pantethine and probucol therapy for Japanese patients with non-alcoholic steatohepatitis［J］.Hepatol Res，2007，37（10）：872-877.

［7］Iqbal M，Sharma SD，Okada S.Probucol as a potent inhibitor of oxygen radical-induced lipid peroxidation and DNA damage：in vitro studies［J］.Redox Rep，2004，9（3）：167-172.

［8］Nakamura N，Obayashi H，Fujii M，et al.Induction of aldose reductase in cultured human microvascular endothelial cells by advanced glycation end products［J］.Free Radic Biol Med，2000，29（1）：17-25.

［9］Du J，Wang L，Liu X，et al.Janus kinase2/signal transducers and activators of transcription signal inhibition regulates protective effects of probucol on mesangial cells treated with high glucose ［J］.Biol Pharm Bull，2010，33（5）：768-772.

［10］Zhou TB，Qin YH，Lei FY，et al.ApoE expression in glomerulus and correlation with glomerulosclerosis induced by adriamycin in rats［J］.Ren Fail，2011，33（3）：348-354.

［11］Kondo S，Shimizu M，Urushihara M，et al.Addition of the antioxidant probucol to angiotensinⅡtype I receptor antagonist arrests progressive mesangioproliferative glomerulonephritis in the rat［J］.J Am Soc Nephrol，2006，17（3）：783-794.