米糠肽對D-半乳糖致衰小鼠線粒體損傷的影響

樊金娟 付巖松 宗立立 張心昱 羅 霞

(沈陽農業大學生物科學技術學院1,沈陽 110866)

(吉林農業大學農學院2,長春 130118)

(中國科學院地理科學與資源研究所3,北京 100101)

米糠肽對D-半乳糖致衰小鼠線粒體損傷的影響

樊金娟1付巖松1宗立立2張心昱3羅 霞1

(沈陽農業大學生物科學技術學院1,沈陽 110866)

(吉林農業大學農學院2,長春 130118)

(中國科學院地理科學與資源研究所3,北京 100101)

利用 D-半乳糖 (D-gal)致衰小鼠模型,探討了米糠肽對小鼠心、腦線粒體錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)活性、丙二醛 (MDA)含量以及總抗氧化能力 (T-AOC)和 Ca2+泵、Na+泵活性的影響,并以透射電鏡觀察了該肽對小鼠肝細胞及線粒體超微結構的影響。結果顯示,與衰老組相比,高劑量米糠肽 (500 mg/kg)可明顯降低小鼠心、腦線粒體MDA含量 (P<0.01),顯著提高 T-AOC(P<0.01)、Mn-SOD活性 (P<0.01)以及 Ca2+泵、Na+泵活性,優于中、低劑量 (200、100 mg/kg);透射電鏡下可見衰老組肝線粒體腫脹明顯,膜模糊不清,有空泡形成,而米糠肽各組線粒體損傷程度有所減輕。說明米糠肽對 D-gal致衰小鼠線粒體損傷起到良好的保護作用,可能具有延緩衰老的效果。

米糠肽 衰老模型 線粒體 超微結構

生物活性肽是具有抗氧化、抗疲勞、調節免疫等多種生理活性的多肽,具有氨基酸不可比擬的功能[1-3]。近年來,活性肽的研究開發受到國內外的廣泛關注。目前對于植物源活性肽的研究主要集中于大豆肽和玉米肽,對米糠肽的研究還不多見。米糠是糙米碾臼過程中被碾下的皮層和少量米胚及碎米的混合物,其蛋白質含量高,氨基酸組成符合WHO/FAO推薦的理想模式[4]。利用 AS1.398中性蛋白酶酶解獲得的米糠肽對鄰苯三酚自氧化產生的超氧陰離子 (O2-·)具有較好的清除作用[5],同時該肽能提高小鼠血清超氧化物歧化酶 (SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶 (GSH-Px)活性,能夠降低腦、肝組織中單胺氧化酶 (MAO-B)活性[6],可能存在抗衰老的功效。

線粒體是維持細胞以至整個機體生理功能的能源中心,被視為細胞衰老的基礎。利用 D-gal致衰小鼠模型,觀察了米糠肽對心、腦線粒體Mn-SOD、T-AOC、Ca2+泵、Na+泵活性及 MDA含量的影響,旨在為開發安全有效的天然抗衰老食品、保健品提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米糠,由沈陽千重浪稻業提供。

昆明種小鼠 60只,體重 18～22 g,雌雄各半,由長春醫學實驗動物研究中心提供,許可證號:SCXK(吉)2008-0001,于本單位標準化動物實驗中心飼養。

總蛋白定量測試盒,T-AOC、SOD、Ca2+泵、Na+泵活性測試盒、MDA含量測試盒:購于南京建成生物工程研究所;D-gal、戊二醛等為分析純。

1.2 儀器與設備

JEM-1200EX透射電子顯微鏡:日本 JEOL公司;U-3010紫外 -可見分光光度計:日本 H ITA2 CH I;JY92-2D超聲波細胞粉碎儀:寧波新芝生物科技股份有限公司;HH-6數顯恒溫水浴鍋:國華電器有限公司;D-37520 Osterode臺式高速冷凍離心機:Thermo公司;T-25 basic ULTRA-TURRAX勻漿機:德國 IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 米糠肽的制備

按本實驗室方法進行[5]:利用 AS1.398中性蛋白酶,在 pH 7.0,溫度 55℃,[E]/[S]=12%條件下,酶解米糠蛋白 6 h,4 000 r/min離心 10 min得到米糠粗肽,含量約為 105 mg/mL。

1.3.2 試驗動物分組及處理

標準飼料飼養小鼠一周后開始正式實驗。將 60只小鼠隨機分為 5組,每組 12只,雌雄各半,分別為對照組,衰老組,米糠肽低、中、高劑量治療組。衰老組和米糠肽各組每日按 100 mg/kg頸背部皮下注射D-gal,對照組注射等量生理鹽水;米糠肽低、中、高劑量組每日分別灌胃米糠抗氧化肽 100、200、500 mg/kg,對照組、衰老組灌胃等量蒸餾水。每日灌胃、注射一次,連續 6周,期間按性別一組兩籠,自由飲食飲水。

末次給藥次日,隨機抽取各組小鼠兩只,脫頸椎處死,迅速取肝臟,切取相同部位 1 mm3組織塊,經2.5%戊二醛、鋨酸雙重固定,丙酮梯度脫水,環氧樹脂包埋,切片,用于電鏡觀察;所有小鼠脫頸椎處死,迅速取腦、心臟,冷生理鹽水沖洗、濾紙吸干,于液氮速凍,-70℃保存,用于線粒體生化指標的測定。

1.3.3 線粒體的制備

冰浴中制備 10%的組織勻漿,4℃2 000 r/min離心 10 min,取上清 10 000 r/min離心 15 min,沉淀物即為線粒體。將分離的線粒體用冰冷的勻漿介質制成混懸液,超聲波破碎線粒體膜。

1.3.4 指標測定

組織蛋白含量、SOD、T-AOC、Ca2+泵、Na+泵活力、MDA含量按試劑盒說明書方法測定。

1.3.5 統計學分析

數據以平均值 ±標準差 (x-±s)表示,采用SPSS13.0統計軟件進行單因素方差分析,用最小顯著差法 (LSD)進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 米糠肽對 D-gal致衰小鼠心、腦線粒體 Mn-SOD活性、MDA含量及 T-AOC活力的影響

衰老時,小鼠抗氧化能力明顯下降,而 MDA水平顯著升高[7-8]。由表 1至表 3可知,與對照組相比,衰老組心、腦線粒體中 Mn-SOD、TAOC活力的降低和MDA含量的升高均呈極顯著(P<0.01)。而米糠肽各組Mn-SOD及 T-AOC活力均有不同程度地提高,與衰老組相比,中、高劑量組提高顯著 (P<0.05或 P<0.01);同時心、腦線粒體MDA含量有不同程度降低,其中高劑量組呈極顯著 (P<0.01),接近對照組。說明米糠肽能夠增強致衰小鼠的抗氧化能力,并呈一定的劑量相關性。

表 1 米糠肽對 D-gal致衰小鼠心、腦線粒體Mn-SOD活性的影響

表 2 米糠肽對 D-gal致衰小鼠心、腦線粒體MDA含量的影響

表 3 米糠肽對D-gal致衰小鼠心、腦線粒體 T-AOC活力的影響

2.2 米糠肽對 D-gal致衰小鼠肝細胞及線粒體超微結構的影響

電鏡觀察可見:對照組小鼠肝細胞 (圖 1a)核膜光滑,核內染色質分布均勻,胞質內有較多的粗面內質網、核糖體及糖原顆粒,線粒體豐富,排列整齊,內外膜完整,嵴清晰可見。衰老組小鼠肝細胞 (圖 1b)核膜稍有切跡,核內異染色質有凝聚,細胞器數量減少,粗面內質網輕度擴張,線粒體出現明顯腫脹,空泡化,內外膜模糊不清,基質密度較低,嵴疏松、斷裂、變形甚至消失等改變,胞質內還見有較多的溶酶體,說明本實驗利用D-半乳糖造模是成功的。與衰老組相比 ,米糠肽各組 (圖 1c、圖 1d、圖 1e)核膜、核內染色質分布狀況有不同程度改善,胞質內有較多線粒體、粗面內質網、核糖體及糖原顆粒,但低劑量組胞質有部分溶解,內可見脂滴。從線粒體看,低劑量組多數嵴減少、外膜局部破損;中劑量組輕度腫脹,基質密度較低,少量外膜局部模糊;高劑量組線粒體豐富,排列整齊,外形基本完整,膜清晰,嵴密集,接近對照組水平。說明米糠肽能夠對衰老時細胞的損傷起到保護作用。

圖 1 米糠肽對D-gal致衰小鼠肝細胞及線粒體超微結構的影響

2.3 米糠肽對 D-gal致衰小鼠心、腦線粒體 Ca2+泵、Na+泵活性的影響

由表 4可知,衰老組心、腦線粒體 Ca2+泵和 Na+泵活性均顯著低于對照組 (P<0.01),而與衰老組相比,不同劑量米糠肽均可增加 Ca2+泵和 Na+泵活性,中、高劑量組可達顯著水平 (P<0.05或 P<0.01)。說明米糠肽對 Ca2+泵、Na+泵活性具有調節能力,并呈一定地劑量相關性。

表 4 米糠肽對 D-gal致衰小鼠心、腦線粒體Ca2+泵、Na+泵活性的影響

3 討論與結論

隨著年齡的增長,機體內自由基產量增多,細胞、組織和器官在形態和功能上將會出現一系列復雜的退行性變化[9-10]。D-半乳糖誘發動物衰老即與自由基毒性和氧化應激損傷有關,已在大鼠和小鼠上證實該模型表現出部分與自然衰老相似的生化變化[11-12]。

線粒體既是體內活性氧、自由基產生的重要場所,又是內源性自由基攻擊的主要對象。過多自由基的產生使線粒體內膜受損,主要表現在:膜脂質過氧化水平升高、膜蛋白變性導致酶活性改變、線粒體數量減少[13];同時膜通透性及離子轉運受影響而觸發 Ca2+內流[14]等。結果表明,經 D-gal處理后,小鼠抗氧化能力下降,脂質過氧化水平升高,Ca2+泵、Na+泵活性降低,線粒體形態結構受損,說明本實驗利用 D-gal建立的衰老模型是成功的。

SOD是生物體內特異清除 O2-·的酶[15],其活性隨年齡下降,引起衰老有關的變化。MDA是脂質過氧化的最終產物,能嚴重破壞膜結構,其含量可反映組織過氧化損傷程度和細胞受損程度[16]。T-AOC的大小代表和反映了機體抗氧化酶系統和非酶系統對外來刺激的代償能力,是反映機體防御體系抗氧化能力強弱和健康程度的綜合性指標。結果表明,米糠肽能有效增強線粒體 T-AOC、Mn-SOD活性,降低MDA產生。說明米糠肽的抗氧化作用是其延緩衰老的重要機制之一。

肝臟是機體物質代謝的關鍵器官,肝細胞的損傷和凋亡是機體衰老的重要標志。肝細胞的凋亡主要表現在細胞核染色質的凝集、線粒體和粗面內質網數量和形態的改變等。結果顯示,在電鏡下可見衰老組小鼠細胞內結構損傷較重,而米糠肽各組損傷狀況有所減輕。其機制可能是米糠肽通過抗氧化作用降低了自由基損傷程度,從而減輕線粒體、內質網等結構的損傷,保護其形態結構及功能的穩定。

Ca2+泵、Na+泵是線粒體呼吸鏈復合體Ⅴ的重要酶系,具有維持細胞內鈣穩態、調節細胞內外 Na+/K+梯度等功能,其活性大小是各種細胞能量代謝及功能有無損傷的重要指標[17]。有研究發現,當衰老或疾病狀態時機體 Ca2+泵、Na+泵活性下降[18]。試驗結果顯示,米糠肽可提高 D-gal致衰小鼠心、腦線粒體 Ca2+泵、Na+泵活性。說明該肽能夠調節細胞內 Ca2+,為其在細胞器水平上實現延緩衰老、預防老年性疾病提供了可能。

綜上所述,米糠肽能夠提高致衰小鼠線粒體 TAOC、Mn-SOD及 Ca2+泵、Na+泵活性 ,降低 MDA含量,保護細胞內部形態結構。說明該肽可增強清除自由基的作用,降低脂質過氧化,減輕衰老所造成的損傷,進而維持細胞在能量代謝上的穩定,在細胞器水平上延緩衰老。同時有資料顯示,米蛋白不含任何抗營養因子,具有低過敏性及良好的消化性和營養性,無毒無害,且風味柔和、顏色清爽[19-20],是天然醫藥保健品的優質原料。因而,將其作為抗衰老食品、營養品開發,前景十分廣闊。

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Effect of Rice Bran Peptides onMitochondria Injury in AgingMice Induced byD-Galactose

Fan Jinjuan1Fu Yansong1Zong Lili2Zhang Xinyu3Luo Xia1
(College of biotechnology,Shenyang AgriculturalUniversity1,Shenyang 110866)
(College of agricultural,Jilin AgriculturalUniversity2,Changchun 130118)
(Institute of Geographical Sciences and Natural Resources Research3,CAS,Beijing 100101)

The agingmice models induced byD-galactose(D-gal)were created to reveal the effect of rice bran peptides on the activity ofmanganese-superoxide dimutase(Mn-SOD),content ofmalonadehide(MDA),to2 tal antioxidation capacity(T-AOC),and activities of Ca2+-Mg2+-ATPase and Na+-K+-ATPase in mice heart and brain mitochondria,aswell as on the ultrastructure of liver cell and mitochondria under transmission electron mi2 croscopy(TEM).Results:Compared with aging group,the rice bran peptidesof 500 mg/kg dose greatly decrease the MDA content(P<0.01),significantly increase the T-AOC activity(P<0.01),and enhance the activitiesofMn-SOD(P<0.01),Ca2+-Mg2+-ATPase and Na+-K+-ATPase in mice heart and brain mitochondria,and the effects in 500 mg/kg dose group is stronger than groups of 200 or 100 mg/kg dose.The livermitochondria ultrastruc2 ture shows typical injury signs under TEM for aging group,whereas the mitochondria appearance of rice bran peptide groups showsmuch better.All these i mply obviousprotective and anti-aging effectof rice bran peptideson the aging mice induced byD-gal.

rice bran peptide,agingmodel,mitochondria,ultrastructure

TS2

A

1003-0174(2011)01-0030-05

遼寧省教育廳重點實驗室項目(2008S207)

2010-02-22

樊金娟,女,1972年出生,副教授,植物資源開發與利用