花生多肽對小鼠免疫功能影響的研究

劉麗娜 何東平 張聲華 王文亮 杜方嶺

(山東省農業科學院農產品研究所1,濟南 250100)

(武漢工業學院食品學院2,武漢 430023)

(華中農業大學食品學院3,武漢 430070)

花生多肽對小鼠免疫功能影響的研究

劉麗娜1,2,3何東平2張聲華3王文亮1杜方嶺1

(山東省農業科學院農產品研究所1,濟南 250100)

(武漢工業學院食品學院2,武漢 430023)

(華中農業大學食品學院3,武漢 430070)

本試驗旨在探討花生多肽對正常小鼠生長發育及免疫功能的影響。通過動物試驗,測定小鼠體重、臟器及免疫器官質量、遲發性超敏反應、自然殺傷細胞 (NK cell)活性、血清免疫球蛋白 (IgG)含量等理化指標及免疫器官的形態學變化。結果表明,花生多肽能夠增加小鼠的體重、臟器質量和臟器指數、免疫器官質量和指數,促進小鼠生長發育。中[200 mg/(kg·d)]、高劑量組[400 mg/(kg·d)]花生多肽能夠調節遲發型超敏反應、增強 NK細胞活性及血清 IgG的含量,顯著提高機體的免疫功能。小鼠免疫器官病理切片觀察結果表明:中、高劑量花生多肽組小鼠脾臟組織淋巴小結生發中心擴張,增加了網狀細胞和漿細胞數目,這提示花生多肽有提高機體免疫的作用。

花生多肽 免疫 臟器指數 免疫器官指數 遲發型超敏反應 自然殺傷細胞 免疫球蛋白

花生多肽含有人體所必須的 8種氨基酸,此外谷氨酸的含量相當高,多肽中分子質量低于 1 000 u的組分高達 90.53%[1]。現代營養研究表明:相對分子質量低于 1 000的短肽極易被吸收,具有較強的生物活性和功能特性[2-3]。試驗采用 Alcalase蛋白酶水解花生冷榨粕制備的花生多肽,在制備過程中采用了膜過濾和低溫干燥等工藝,產品得率 86.79%,水解度 19.61%。對花生多肽的營養及免疫功能進行研究,從花生多肽對小鼠臟器質量、指數及理化性質及形態學變化的影響等方面來探討花生多肽對小鼠免疫功能的影響,為廣泛開發利用花生多肽提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗動物:SPF級健康雄性昆明小鼠,120只,2周齡,體重 (15±2)g,由湖北省疾病預防控制中心提供,許可證號:SCXK(鄂)2008-0005;花生冷榨粕:山東德州宏鑫花生蛋白食品有限公司提供;IgG放免分析藥盒:原子高科股份有限公司;NK細胞試劑盒:美國 ADL公司;普通小鼠飼料:湖北省醫學科學院實驗動物中心;其他試劑均為分析純。

FS-1型勻漿器:江蘇省金壇市晶玻實驗儀器廠;2-16K型高速冷凍離心機:美國 Sigma公司;DFM-96型 10管放射免疫γ計數器:安徽合肥眾成機電有限公司;Model550多功能酶標儀:日本 Bio-RAD公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 花生多肽的制備

花生多肽制備工藝流程如下[4]:冷榨花生餅→浸出 (50℃,兩次各 3 h)→堿溶 (料液比 1∶10,50℃,2 h,pH 8.5)→離心→上清液→酸沉 (pH 4.5)→離心→沉淀→酶解 (加酶量 75 AU/kg底物,料液比 1∶10,45℃,2.5 h,pH 8.0)→滅酶 (pH 4.0～4.5)→離心→超濾→冷凍干燥→花生多肽。

所得花生多肽為乳白色粉末,可溶性氮質量分數 90.87%,4℃保存備用。

1.2.2 試驗動物飼養及給藥[5]

動物飼養室溫度為 24℃,濕度為 65%～80%。每只小鼠每天 5 g飼料,試驗動物預飼 1周后,隨機分為 4組:對照組,以 200 mg/(kg·d)花生蛋白灌胃小鼠 (以小鼠耐受度為人體 5倍計算)、花生多肽低、中、高劑量組 ,分別以 100、200、400 mg/(kg·d)花生多肽灌胃小鼠。每組 30只。同天開始灌胃,每天灌胃一次,連續 5周后,進行試驗。

普通飼料組成 (以 50 kg飼料計算):玉米20.625 kg,麩皮 17.5 kg,豆粕 8 kg,魚粉 3.125 kg,食鹽 0.125 kg,貝粉 0.75 kg,微量元素 50 g,維生素5 g,鋅 2 g。

1.2.3 觀察小鼠生長情況及體重的變化

喂養中,觀察小鼠活動的能力,并且每 3天稱量體重 1次。

1.2.4 花生多肽對小鼠免疫器官質量及免疫器官指數[6-7]

處死小鼠后立即取出脾臟及胸腺,用吸水紙吸去污血,稱重,免疫器官指數以免疫器官質量 (mg)與體重 (10 g)之比表示。

1.2.5 小鼠脾臟、胸腺病理切片觀察[8]

取出小鼠的脾臟及胸腺后,吸去表面的污血,固定于 10%福爾馬林溶液中,HE染色觀察。

HE染色方法:石蠟切片,厚度 4μm,裱于干凈載玻片上,60℃烤片機上烤片 2 h,二甲苯脫蠟 2次,每次 15 min,依次用無水乙醇,95%乙醇,80%乙醇,蒸餾水處理至透明,蘇木素染核胞 5～10 min,10%鹽酸酒精分化,自來水沖 15 min(返藍),樹脂膠封片。在光學顯微鏡下觀察。

1.2.6 花生多肽對正常小鼠遲發性超敏反應(DTH)的影響[9-10]

飼養 5周后的 4組小鼠中,每組取出 10只,于小鼠腹部脫毛約 3 cm×3 cm的面積,以 1%DNFB液(以 1∶1丙酮麻油液配制)涂于脫毛區,0.05 mL/只。第二天加強一次。然后繼續喂養不同的飼料,5 d后,以 1%DNFB液涂于小鼠右耳 (雙面),0.01 mL/只,24 h后,脫臼處死,剪下小鼠的左右耳,用打孔器分別在左右耳相同部位打下直徑為 8 mm的圓片,用分析天平稱重,右耳質量減去左耳質量為腫脹度。

腫脹度 (mg)=右耳質量 -左耳質量

1.2.7 小鼠血清免疫球蛋白 (IgG)含量的測定[11-13]

飼養 5周后的 4組小鼠中,每組取出 10只,眼球取血,并分離得到血清。

取小鼠血清 20μL,加入緩沖液 1 mL混勻,再取稀釋的血樣 20μL血清,另加入緩沖液 1 mL混勻,然后按 IgG放免試劑盒具體操作說明進行測定。

1.2.8 NK細胞活性測定[7]

取飼養 5周后的小鼠的脾臟,用 PBS緩沖溶液清洗 2次,除去表面血污,剪刀剪碎,冰浴中勻漿(1 g組織 /5 mL PBS緩沖液),-20℃凍融 2次,破膜;離心 10 min(4℃,5 000 r/min),上清液即為脾臟標本溶液。然后按試劑盒操作說明進行測定。

1.2.9 統計學方法

采用-x ±S表示相關指標,應用 t檢驗進行統計學處理。

2 結果與討論

2.1 飼養過程中一般觀察和大體解剖觀察[14-15]

小鼠在飼養過程中無異常現象,進食、飲水、糞便和活動等情況均正常。動物解剖后,觀察各臟器情況,沒有病變。

2.2 花生多肽對小鼠體重變化的影響

花生多肽對小鼠體重變化的影響見表 1,花生多肽各劑量組小鼠的體重與對照組相比有不同程度的提高,發生明顯變化出現在第 3周的時間。第 3周時,各劑量組小鼠體重明顯高于對照組小鼠。隨著喂養時間的延長,這種趨勢更加明顯,并且體重的增加與劑量呈劑量對應關系。

表 1 花生多肽對小鼠體重的影響(-x ±S,n=10)

2.3 花生多肽對小鼠免疫器官質量及免疫器官指數的影響

從表 2中可以看出,花生多肽對小鼠的免疫器官有一定的影響,但是未表現出較顯著的差異。一般表現為中劑量的花生多肽小鼠的免疫器官質量及其指數較對照組小鼠的要高。這提示中劑量的花生多肽有較強的增加機體免疫功能的作用。

表 2 花生多肽對小鼠免疫器官及其指數的影響(-x±S,n=10)

2.4 小鼠脾臟、胸腺病理切片觀察

2.4.1 脾臟病理切片

對照組、花生多肽低、中、高劑量組小鼠的脾臟病理切片圖見圖 1。

對照組及各劑量組小鼠脾臟被膜、小梁、紅髓、白髓結構清楚,中央動脈、淋巴小結、淋巴索形態清晰,分布較均勻。如圖 1 d所示中、高劑量組小鼠脾臟淋巴小結生發中心擴張,細胞核較大,網狀細胞明顯,數目較多,漿細胞增多,其分泌的抗體也會增加,這提示高劑量組小鼠免疫力會有所增強。低劑量組無明顯變化。

圖 1 小鼠脾臟病理切片

2.4.2 胸腺病理切片

對照組、花生多肽低、中、高劑量組小鼠的胸腺病理切片圖見圖 2。

對照組及各劑量組小鼠胸腺小葉、皮質、髓質結構清楚,胸腺細胞,上皮網狀細胞、胸腺小體等形態清晰。但如圖 2所示高倍鏡下觀察各劑量組組織結構與對照組相比無明顯差異。這說明雖然生化指標發生了變化,免疫力有所增強,但這些變化不足以引起胸腺形態學上的變化。

圖 2 小鼠胸腺病理切片

2.5 花生多肽對正常小鼠遲發性超敏反應 (DTH)的影響

從表 3中可知,其中低劑量組[100 mg/(kg·d)]小鼠的遲發性超敏反應腫脹度要顯著高于對照組(P<0.05)。添加中劑量組 [200 mg/(kg·d)]小鼠的腫脹度極顯著的高于對照組 (P<0.01)。高劑量組[400 mg/(kg·d)]小鼠的腫脹度雖然與對照組相比也具有顯著性,但是下降了。這說明一定劑量的花生多肽可以提高正常小鼠的免疫功能。所用的 3個劑量中,中劑量的花生多肽 [200 mg/(kg·d)]是提高正常小鼠免疫功能的最佳劑量。

表 3 花生多肽對正常小鼠遲發性超敏反應的影響(-x±S,n=10)

2.6 花生多肽對正常小鼠 IgG含量的影響

花生多肽對小鼠 IgG含量的影響見表 4,通過放免法測定小鼠血清中 IgG的含量,各花生多肽劑量組小鼠的血清 IgG的含量與對照組相比,其值雖然都沒有表現出非常顯著的差異,但在一定程度上都有所增加。這說明花生多肽在一定程度上對小鼠的體液免疫有所增強。2.7 花生多肽對小鼠脾臟 NK細胞活性的影響

表 4 花生多肽對正常小鼠 IgG含量的影響(-x±S,n=10)

NK細胞活性的測定結果如見表 5。與對照組相比,各劑量組小鼠 NK細胞活性均有增強。高劑量組[400 mg/(kg·d)]極顯著的高于對照組 (P<0.01),呈劑量 -效應關系。

表 5 花生多肽對小鼠NK細胞活性的影響(-x ±S,n=10)

3 討論與結論

3.1 花生多肽對小鼠體重的影響

隨著喂養的時間的延長,花生多肽對小鼠體重的影響越明顯。喂養的時間越長,劑量越大,與對照組相比,小鼠體重增加顯著。說明花生多肽在一定程度上促進了小鼠的生長。

3.2 花生多肽對小鼠免疫器官和免疫器官指數的影響

花生多肽對小鼠的免疫器官質量和指數有一定的影響,但與對照組相比未表現出較顯著的差異。通過觀察小鼠脾臟的病理切片,高劑量組[400 mg/(kg·d)]小鼠脾臟淋巴小結生發中心擴張,網狀細胞數目較多,漿細胞增多,其分泌的抗體也會增加,這提示花生多肽有增加小鼠免疫功能的作用。

3.3 花生多肽對小鼠免疫功能的影響

遲發型超敏反應和 NK細胞活性是細胞免疫常用的評價指標,兩者的測定結果可以反映出藥物的免疫調節功能[16-18]。本試驗研究結果顯示,各劑量組均有提高小鼠遲發型超敏反應及 NK細胞活性的作用,有增強小鼠免疫功能的效果。

血清中 IgG是全身性體液免疫反應的效應因子,是再次體液免疫應答產生的主要免疫球蛋白,在血液中含量最高,在機體防御中發揮抗感染、中和毒素及調理等作用,其含量在一定程度上也反映了對機體體液免疫的調節功能[19-21]。試驗表明,花生多肽能夠提高小鼠血清中 IgG含量,可以進一步說明:一定劑量的花生多肽可以在一定程度上增強機體的體液免疫能力。

[1]劉麗娜,何東平,張聲華.花生蛋白水解工藝的優化 [J].糧油加工,2008,11:60-63

[2]Gri mble G K,Silk D B A.Intravenous protein hydrolysates time to turn the clock back[J].Clinical Nutrition,1990,9(1):39-45

[3]頓新鵬,陳正望.酶法水解米渣蛋白制備大米小分子肽[J].食品科學,2004,25(6):113-116

[4]張宇昊,王強.酶水解花生蛋白制備花生短肽的研究[J].農業工程學報.2007,23(4):258-263

[5]施新猷.醫用實驗動物學 [M].西安:陜西科學技術出版社,1989,492

[6]徐叔云,卞如濂,陳修主編.藥理實驗方法學 [M].北京:人民衛生出版社,1982:945,934

[7]徐叔云,卞如濂,陳修主編.藥理實驗方法學 [M].北京:人民衛生出版社,2002,1429-1436

[8]張均田主編.現代藥理學實驗方法 [M].北京:北京醫科大學中國協和醫科大學聯合出版社,1998:255-273

[9]張曉君,祝晨蔯,胡黎,等.黨參多糖對小鼠免疫和造血功能的影響[J].中藥新藥與臨床藥理,2003,14(3):174-176

[10]中華人民共和國衛生部.新藥 (中藥)臨床前研究指導原則匯編[M].1993,7:124

[11]錢玉昆.實用免疫學新技術 [M].北京:北京醫科大學中國協和醫科大學聯合出版社,1995:11-15

[12]Tryphonas H,Bondy G,Miller J D,et al.Effects of fumonism B1 on the immune system of sprague-dawley rats folliwing a 14-day oral(gavage)exposure[J].Fundamental and Applied Toxicology,1997,39:53-59

[13]Tryphonas H,Cooke G,CaldwellD,et al.Oral(gavage),in utero and post-natal exposure of Sprague-Dawley rats to low doses of tributyltin chloride:Part II:effects on the im2 mune system[J].Food and Chemical Toxicology,2004,42:227-241

[14]苗明三.實驗動物和動物實驗技術[M].北京:中國中醫出版社,1997

[15]王世若,王興農,韓文瑜.現代動物免疫學 [M].吉林:吉林科學技術出版社,2001

[16]徐明清,黃燕虹,張志,等.羅哌卡因對外周血 CD3 CD4 CD8 CD20 I L-2 I NF-γ影響的研究 [J].河北醫學,2005,11(9):774-776

[17]LusterM I,Portier C,PaitD G.Risk assess ment in immuno2 toxicology sensitivity and predictability of immune tests[J].Fundamental and Applied Toxicology,1992,18:200-210

[18]SuniM A,Ghanekar S A,Houck D W.CD4+CD8 low T lymphocytes exhibit enhanced cytokine expression,prolifera2 tion and cytotoxic activity in response to HCMV and H I V-1 antigens[J].Eur I mmunol,2001,31:512-520

[19]李強翔,文格波,顏向軍,等.氨基胍和維生素 C對糖尿病大鼠免疫功能影響的實驗研究[J].實用預防醫學,2005,12(1):80-82

[20]Liu H,Zhu Y.Effect ofalcohol extract of Zingben oflicinale rose on immunologic function of mice to tumor[J].Journal Of Hygiene Research,2002,31(3):208-209

[21]Glush Kova O V,Novoselove E G,OgaiV B.Effect of centi2 metermi crowaves on the antibody production in mice[J].Biofizika.2001,46(1):126-130.

Effects of Peanut Peptides on I mmune Function ofMice

Liu Lina1,2,3He Dongping2Zhang Shenghua3WangWenliang1Du Fangling1
(Institute ofAgro-Food Science and Technology,Shandong Academy ofAgricultural Sciences1,Jinan 250100)
(College of Food Science and Technology,HuazhongAgriculturalUniversity2,Wuhan 430070)
(College of Food Science and Engineering,Wuhan Polytechnic University3,Wuhan 430023)

This study aims to explore the effect of peanut peptides(PPs)on growth and immune function of mice through animal experiment and observation of the trend of bodyweight and immune organs.Results:PPs accel2 erates the growth and development ofmice to a certain extent.PPs atmiddle dosage[200 mg/(kg·d)]or high dos2 age[400 mg/(kg·d)]have obvious action on promoting the reaction ability of delayed type hypersensitivity(DTH),and raising the levelofNatural Killer cell(NK cell)activity and contentof serum IgG inmice.PPs i mprove the non2 specific and specific immune ability ofmice.From pathological observation of spleen,the number of reticulocyte and plasma cellof spleen in mice fed with PPs atmiddle or high dosage are increased.These imply PPs could improve the immune function ofmice.

peanut peptides(PPs),immunity,viscera index,immune organ index,DTH,NK cell,IgG

TS201.4

A

1003-0174(2011)01-0079-05

公益性行業 (農業)科研專項 (200903043-3-2),農業部科技成果轉化項目 (2009C60050),山東省自主創新成果轉化重大專項(2009ZHZX1A1303)

2009-12-07

劉麗娜,女,1978年出生,博士,農產品加工

杜方嶺,男,1972年出生,研究員,農產品加工