菜籽粕混菌固態(tài)發(fā)酵制備多肽飼料的研究

顧 斌 馬海樂,2 劉 斌

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院1,鎮(zhèn)江 212013)

(江蘇省農(nóng)產(chǎn)品生物加工與分離工程技術(shù)研究中心2,鎮(zhèn)江 212013)

菜籽粕混菌固態(tài)發(fā)酵制備多肽飼料的研究

顧 斌1馬海樂1,2劉 斌1

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院1,鎮(zhèn)江 212013)

(江蘇省農(nóng)產(chǎn)品生物加工與分離工程技術(shù)研究中心2,鎮(zhèn)江 212013)

以菜籽粕為原料,以發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)、多肽得率和硫苷含量為評價指標(biāo),通過米曲霉、白地霉、熱帶假絲酵母、釀酒酵母和枯草芽孢桿菌的單菌及混菌發(fā)酵,進(jìn)行最佳發(fā)酵菌種組合的研究;通過最佳混菌的單因素試驗,研究在培養(yǎng)基中添加無機(jī)鹽 (CaCl2、K2HPO4、MgSO4、FeSO4和 CuSO4)、氮源[CO(NH2)2、(NH4)2SO4、KNO3、NH4Cl和 NH4HCO3)]、輔料 (麩皮、玉米粉和米糠 )和料水比對發(fā)酵效果的影響。以發(fā)酵產(chǎn)物的多肽得率為評價指標(biāo),通過正交試驗優(yōu)化培養(yǎng)基的組成。結(jié)果表明,白地霉和枯草芽孢桿菌為最佳發(fā)酵混合菌種;培養(yǎng)基中 CaCl2是最好的無機(jī)鹽,NH4Cl是最好的無機(jī)氮源,3種輔料的添加對發(fā)酵效果均沒有顯著的改善作用;最優(yōu)培養(yǎng)基組成是:CaCl20.1%、NH4Cl 1.5%、料水比 1∶1.2,使用最優(yōu)培養(yǎng)基進(jìn)行混菌發(fā)酵,多肽得率高達(dá) 12.81%。

菜籽粕 固態(tài)發(fā)酵 混菌 多肽 硫苷

我國年產(chǎn)菜籽餅粕約 769萬噸,菜籽餅粕含有35%～45%蛋白質(zhì)[1]。因此菜籽粕應(yīng)當(dāng)成為很好的蛋白飼料原料,但實際情況并未如此,主要原因有兩個:一是非雙低菜籽的粕中硫苷等抗?fàn)I養(yǎng)因子含量較高;二是菜籽粕中蛋白的消化吸收率較低[2],尤其是壓榨制油工藝得到的餅粕。目前,對菜籽粕的研究主要集中在脫毒方面,而對生產(chǎn)富含更容易被動物消化吸收的多肽飼料研究不多[3]。

多肽飼料就是通過化學(xué)或生物方法將本來不適合動物利用的蛋白原料分解,制成的含有大量多肽的飼料產(chǎn)品[4]。目前生產(chǎn)多肽飼料的方法主要有酸解法、酶解法和微生物發(fā)酵法[4]。

與其他兩種方法相比,微生物發(fā)酵法不但能將大分子植物蛋白降解成多肽,而且能提高粗蛋白含量和降解硫苷等抗?fàn)I養(yǎng)因子。目前國內(nèi)外同類研究存在的問題是,在提高蛋白含量、降硫苷、降解大分子植物蛋白三個方面不能很好的兼顧,因此本試驗利用多菌種發(fā)酵菜籽粕生產(chǎn)多肽蛋白飼料,篩選出在降低硫苷含量、提高蛋白質(zhì)含量、降解大分子蛋白質(zhì)三個方面都表現(xiàn)較優(yōu)的菌種,在此基礎(chǔ)上合理組合混菌發(fā)酵,篩選出綜合表現(xiàn)較好的菌種組合,再以多肽得率為目標(biāo)對發(fā)酵培養(yǎng)基的組成進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

菜籽粕 (真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù) 22%,硫苷含量 64.83 μmol/g,含水量 4.47%):丹陽市正大油脂有限公司提供。麩皮、米糠、玉米粉:市售。

1.1.2 菌種

白地霉 (Geotrichum candidum2.1132)、米曲霉 1(Aspergillus oryzae3.4383)、米曲霉 2(Aspergillus oryzae3.5232):中國微生物菌種保藏中心;熱帶假絲酵母 (Candida tropicalisC3161)、枯草芽孢桿菌 (B a2 cillus subtilusM5112):江蘇大學(xué)三環(huán)生物工程成套設(shè)備有限公司;釀酒酵母 (Saccharom yces cerevisiae):本實驗室保藏。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基;麥芽汁培養(yǎng)基 (培養(yǎng)酵母菌、白地霉)、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 (培養(yǎng)枯草芽孢桿菌)、Czapek’s培養(yǎng)基 (培養(yǎng)米曲霉 )。

菌種篩選培養(yǎng)基:在 250 mL三角瓶中加入菜籽粕 20 g、麩皮 2 g、尿素 0.6 g、20 mL水 ,攪拌均勻 ,121℃高壓滅菌 15 min后備用。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基:在 250 mL三角瓶中加入菜籽粕 20 g,20 mL水?dāng)嚢杈鶆?121℃高壓滅菌 15 min后備用。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基:在 250 mL三角瓶中加入 20 g菜籽粕,根據(jù)試驗設(shè)計添加無機(jī)氮、金屬離子、輔料和水,攪拌均勻,121℃高壓滅菌后備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 菜籽粕固態(tài)發(fā)酵流程

1.2.2 單菌發(fā)酵試驗

將米曲霉、白地霉、熱帶假絲酵母、釀酒酵母和枯草芽孢桿菌分別在液體培養(yǎng)基上活化后,按 10%接種量分別接種到菌種篩選培養(yǎng)基中,在 30℃培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng) 3 d。發(fā)酵產(chǎn)品在 60℃烘干 24 h,測定其真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)、硫苷含量、多肽得率。

1.2.3 混菌發(fā)酵試驗

根據(jù)單菌發(fā)酵試驗,選擇真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高、硫苷含量最低和多肽得率最高的菌種,合理組合,混菌發(fā)酵 (菌種接入不分先后,總接種量仍為 10%),在30℃培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng) 3 d。發(fā)酵產(chǎn)品在 60℃下烘干 24 h,測定其真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)、硫苷含量、多肽得率。

1.2.4 培養(yǎng)基成分的優(yōu)化

采用單因素試驗分別考察無機(jī)鹽、氮源、輔料種類及添加量、培養(yǎng)基料水比對混菌發(fā)酵菜籽粕綜合效果的影響。考察單一因素時,其他因素分別是料水比 (g/mL)1∶1,不添加氮源、無機(jī)鹽和輔料。根據(jù)單因素試驗結(jié)果,以多肽得率為指標(biāo),通過正交試驗對發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。

1.3 檢測方法

1.3.1 真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

[5]測定。

1.3.2 硫苷含量測定

氯化鈀分光光度法[6]。

1.3.3 多肽得率測定

參考文獻(xiàn)[7]測定。用標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白溶液測定得到的多肽濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線是:

y=0.075 8x+0.001 8

式中:y為吸光值;x為多肽質(zhì)量濃度 /mg/mL。多肽得率按照下式計算:

式中:V為待測液體積/mL;m為樣品總質(zhì)量/mg;U為多肽得率/%。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株篩選

2.1.1 單菌株發(fā)酵試驗

米曲霉 1(Ao1)、米曲霉 2(Ao2)、白地霉 (Gc)、熱帶假絲酵母 (Ct)、釀酒酵母 (Sc)和枯草芽孢桿菌(Bs)的單菌發(fā)酵菜籽粕試驗結(jié)果如表 1所示。

表 1 不同微生物單菌發(fā)酵對硫苷、蛋白、多肽得率的影響

由表 1可知米曲霉 1、枯草芽孢桿菌具有較高的硫苷降解能力,米曲霉 1發(fā)酵硫苷降解率達(dá)到66.8%。米曲霉 1發(fā)酵后真蛋白質(zhì)含量反而減少,這可能是因為米曲霉把真蛋白降解成了非蛋白氮。白地霉、釀酒酵母發(fā)酵真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高顯著,白地霉發(fā)酵真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到 34.8%,與原料相比提高了 12.8%左右。真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高主要有兩方面的原因:一是菌體利用氮源合成了菌體蛋白;二是菌體發(fā)酵后底物減重的“濃縮效應(yīng)”[8]。枯草芽孢桿菌發(fā)酵后多肽得率最高,達(dá)到 10.3%。總的來說,單菌發(fā)酵在降解硫苷、提高真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)、生產(chǎn)多肽三個方面不能很好的兼顧。

2.1.2 混菌發(fā)酵試驗

根據(jù)單菌株發(fā)酵試驗結(jié)果,選擇提高真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)效果較好的白地霉和釀酒酵母,降解硫苷能力最強(qiáng)的米曲霉 1和枯草芽孢桿菌以及生產(chǎn)多肽最多的枯草芽孢桿菌,進(jìn)行雙菌、三菌、四菌混菌發(fā)酵,試驗結(jié)果如表 2。

表 2 不同混菌組合混菌發(fā)酵效果

比較表 1和表 2發(fā)現(xiàn),混菌發(fā)酵能較大幅度的提高真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù),顯著優(yōu)于單菌發(fā)酵。這是因為混菌發(fā)酵時多菌體系中微生物生長狀況優(yōu)于單菌發(fā)酵體系微生物生長狀況,使發(fā)酵產(chǎn)物中的菌體數(shù)目增多,消耗的碳源、能源物質(zhì)相應(yīng)增加,使發(fā)酵產(chǎn)物的得率減少,出現(xiàn)了較大的蛋白質(zhì)“濃縮效應(yīng)”,最終導(dǎo)致了產(chǎn)物真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加。但是除了白地霉和枯草芽孢桿菌的組合,其余組合多肽得率都沒明顯增大,硫苷含量沒有明顯降低,甚至某些組合發(fā)酵不如單菌發(fā)酵效果,原因可能有兩個:一是因為試驗保證總接種量不變,每種菌的接種量相對減少,因此影響了發(fā)酵的總體效果[9];二是因為菌種之間可能存在拮抗作用。綜合考慮,本試驗選用白地霉和枯草芽孢桿菌混菌發(fā)酵。

2.2 菜籽粕發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.2.1 無機(jī)鹽選擇

向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加 0.1 g的無機(jī)鹽 CaCl2、K2HPO4、MgSO4、FeSO4和 CuSO4,提供金屬離子 ,結(jié)果見圖 1。以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵試驗為對照,添加所有的無機(jī)鹽都會有利于真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高,但是只有添加 CaCl2才有助于提高硫苷的降解以及多肽得率,這可能是因為 Ca2+是蛋白酶和芥子酶的激活劑。

圖 1 不同無機(jī)鹽對發(fā)酵效果的影響

2.2.2 CaCl2添加量對發(fā)酵效果的影響

CaCl2添加量對發(fā)酵效果的影響如圖 3所示。由圖 3可以看出,隨著 CaCl2添加量的提高,硫苷、真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化不明顯,多肽得率先升高后降低,可能有兩個原因:一是 CaCl2濃度太高反而會抑制蛋白酶的活性;二是鹽濃度的提高會改變滲透壓,滲透壓過高會抑制微生物的生長[10]。

圖 2 CaCl2添加量對發(fā)酵效果的影響

2.2.3 氮源的選擇

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加 3%的氮源 CO(NH2)2、(NH4)2SO4、KNO3、NH4Cl和 NH4HCO3發(fā)酵后 ,結(jié)果見圖 3。

圖 3 不同氮源對發(fā)酵效果的影響

由圖 3可知,與不添加氮源相比,添加氮源對真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響不顯著,這可能是因為菜籽粕中已經(jīng)有足夠的非蛋白氮可轉(zhuǎn)化為蛋白氮。添加NH4Cl可顯著提高多肽得率,因此本試驗選擇添加NH4Cl。這與袁建等[7]研究得到的添加尿素可顯著提高多肽得率的結(jié)果不一致,其原因還需要今后進(jìn)一步研究。

2.2.4 NH4Cl添加量對發(fā)酵效果的影響

圖 4 NH4Cl添加量對發(fā)酵效果的影響

NH4Cl添加量對發(fā)酵效果的影響見圖 4。從圖 4可見,隨著 NH4Cl添加量的增加,硫苷含量變化不大。添加小于 4.5%的 NH4Cl,真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)與不添加相比都略有提高,但添加量過多反而不利于真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高。多肽得率受 NH4Cl添加量的影響顯著,隨著添加量的增加先增大后減小,添加3%時含量最高。

2.2.5 輔料的選擇

輔料的作用主要是增加發(fā)酵基質(zhì)的碳氮源,使基質(zhì)的碳氮比更為合理。在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別摻入 10%的麩皮、玉米粉和米糠 3種輔料發(fā)酵,發(fā)酵結(jié)果見圖 5。

圖 5 不同輔料對發(fā)酵效果的影響

從圖 5可見,添加不同的輔料,3項指標(biāo)都沒有明顯的改善,反而會使指標(biāo)降低,因此在下面的試驗中不添加任何輔料。

2.2.6 料水比對發(fā)酵效果的影響

設(shè)計料水比 (質(zhì)量比 )分別為 1∶0.6、1∶0.8、1∶1、1∶1.2、1∶1.4共 5個水平 ,考察了其對發(fā)酵效果的影響,結(jié)果如圖 6所示。

圖 6 料水比對發(fā)酵效果的影響

含水量的多少對微生物的生長和代謝能力都有顯著影響,含水量過低,造成基質(zhì)膨脹程度低,物料較干燥,微生物難以生長,產(chǎn)酶量降低;含水量過高,減少了基質(zhì)內(nèi)氣體體積和氣體交換,也不利于菌種的生長。由圖 8可見,隨著含水量的增加,真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化甚微,硫苷含量在較小的范圍內(nèi)先增后降,多肽得率的變化最為顯著。綜合考慮三項指標(biāo),初始料水比選擇 1∶1.2。

2.2.7 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果,選擇料水比、CaCl2的添加量和 NH4Cl添加量為影響因素,并分別選取 3個水平,以發(fā)酵物料多肽得率為指標(biāo),在不考慮交互作用的情況下,進(jìn)行正交試驗。選用 L9(34)正交表,因素水平見表 4,試驗結(jié)果見表 4。

表 3 正交試驗因素及水平

表 4 正交試驗結(jié)果及計算表

表 5 正交試驗方差分析表

根據(jù)表 4可知,各因素對多肽得率的影響是CaCl2添加量 >料水比 >NH4Cl添加量。根據(jù)表 5方差分析可知,料水比與 CaCl2含量對混菌發(fā)酵菜籽粕生產(chǎn)多肽有顯著影響,NH4Cl含量對多肽得率影響不顯著。因此發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳條件是 CaCl2添加量 0.1%、料水比 1∶1.2、NH4Cl添加量 1.5%。由于正交表沒有該項培養(yǎng)基組成,追加試驗結(jié)果表明多肽得率達(dá)到 12.81%。

3 結(jié)論

3.1 單菌發(fā)酵試驗表明,枯草芽孢桿菌發(fā)酵得到的多肽最多,白地霉、熱帶假絲酵母、釀酒酵母發(fā)酵菜籽粕真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高,米曲霉 1降解硫苷的能力最強(qiáng)。

3.2 混菌發(fā)酵試驗表明,混菌發(fā)酵與單菌相比更有利于提高蛋白質(zhì)含量,白地霉和枯草芽孢桿菌組合發(fā)酵菜籽粕綜合效果最好。

3.3 單因素和正交試驗得出,當(dāng)料水比為 1∶1.2、CaCl2為 0.1%、NH4Cl為 1.5%時,多肽得率達(dá)到最大,達(dá)到 12.81%。

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Preparation ofBio-Feedstuffwith Rich Peptides from RapeseedMeal byMixed Solid Fer mentation

Gu Bin1Ma Haile1,2Liu Bin1
(School of Food and Biological Engineering,Jiangsu University1,Zhenjiang 212013)
(Jiangsu Provincial Research Center ofAgricultural ProductsBio-processing and Separation Engineering2,Zhenjiang 212013)

Rapeseed mealwas used to prepare bio-feedstuffwith rich peptide by single ormixed strains solidfer mentation.The used strains includedAspergillus oryzae(Ao),Geotrichum candidum(Gc),Candida tropicalis(Ct),Saccharom yces cerevisiae(Sc)andBacillus subtilus(Bs).Effects of single or mixed strains solid-fer mentation on contents of true protein,peptide and glucosinolate in the fer mentation productwere investigated to search optimal com2 bination of cultures. Taking peptide content as evaluation index,the effects of inorganic salt(such as CaCl2,K2HPO4,MgSO4,FeSO4and CuSO4),nitrogen sources[such as urea CO(NH2)2,(NH4)2SO4,KNO3,NH4Cl and NH4HCO3],accessory(such aswheat bran,corn flour and rice bran)and solid/liquid ratio in the culturemedium on the fer mentation processwere studied by single factor tests,and the composition of culture medium was opti mized by an orthogonal experiment.Results:Gc and Bs is the opti mal fer mentation mixed strains;CaCl2is the best inorganic salt in the culture medium and NH4Cl is the best nitrogen sources.Three kinds of accessory show no remarkable im2 provement on the fer mentation effect.The composition of optimal culture medium is CaCl20.1%,NH4Cl 1.5%and solid/liquid ratio 1∶1.2.The product peptide content of fer mentation with the optimal culture medium reaches 12.81%.

rapeseed meal,solid-state fer mentation,mixed strains,peptide,glucosinolate

S816.4

文章編號:1003-0174(2011)01-0083-05

江蘇省科技成果轉(zhuǎn)化專項資金(BA2008100)

2010-01-28

顧斌,男,1985年出生,碩士,食品科學(xué)

馬海樂,男,1963年出生,教授,博士生導(dǎo)師,降血壓肽、飼料