液態發酵法制備菜籽ACE 抑制肽發酵條件優化

鞠興榮 金 晶 王立峰,2 袁 建 何 榮,2

(南京財經大學食品科學與工程學院 江蘇省糧油品質控制及深加工技術重點實驗室1,南京 210003)(江南大學食品學院2,無錫 214122)

液態發酵法制備菜籽ACE 抑制肽發酵條件優化

鞠興榮1金 晶1王立峰1,2袁 建1何 榮1,2

(南京財經大學食品科學與工程學院 江蘇省糧油品質控制及深加工技術重點實驗室1,南京 210003)(江南大學食品學院2,無錫 214122)

以菜籽粕為原料,通過枯草芽孢桿菌液態發酵生產菜籽 ACE抑制肽。先以肽得率、ACE抑制率為指標通過單因素試驗得到液態發酵的發酵條件,再以響應面法分析法,優化了枯草芽孢桿菌液態發酵的工藝條件,確定枯草芽孢桿菌液態發酵生產菜籽 ACE抑制肽的最佳發酵工藝條件為發酵時間,發酵溫度和接種量,最佳工藝條件分別為 20 h、38℃和 1×108個 /mL。優化后的菜籽 ACE抑制肽抑制率達到 70.95%。

枯草芽孢桿菌 菜籽肽 液態發酵 ACE抑制肽 響應面分析法

ACE(血管緊張素轉化酶)抑制劑通過抑制 ACE的活性而達到降血壓的作用,目前使用的很多合成的ACE抑制劑在降血壓的同時會產生一定的副作用[1],而植物源 ACE抑制肽具有安全性高,副作用少,易吸收的優點[2],因此成為了ACE抑制肽研究的熱點。菜籽粕是菜籽榨油之后的副產品,其中蛋白質量分數為 35%～42%,且為優質的蛋白質[3-4]。將菜籽粕發酵制備 ACE抑制肽,可以充分的利用菜籽蛋白資源,達到變廢為寶的作用。目前發酵法制備大豆和牛奶的ACE抑制肽的研究在我國已有報道[5-7],而使用液態發酵制備菜籽ACE抑制肽的研究目前在國內還屬于空白,因此具有很高的研究價值。

在利用枯草芽孢桿菌 10160液態發酵生產菜籽肽培養基優化的基礎上,著重探討了搖床轉速、接種量、發酵溫度、發酵時間對發酵效果的影響,應用單因素和響應面分析法 (Response surface analysis,RSA)對菜籽液態發酵的發酵工藝條件進行優化,以ACE抑制率為響應值,采用多元二次回歸擬合出方程,得到了液態發酵生產菜籽蛋白肽的最佳發酵工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料

B acillus.subtilis10160等產蛋白酶菌種:中國工業微生物菌種保藏中心;菜籽粕,以 canola菜籽為原料,通過索氏抽提脫油制得,含粗蛋白 43.26%;牛血清白蛋白、細胞色素、鈷胺酰胺 (VB12)、Gly-Gly-Tyr-Arg、ACE(0.25U)、HHL、Gly-Gly-Tyr-Arg:Sigma公司;其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設備

立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋:上海申安醫療器械廠;GL-20B型高速冷凍離心機:上海安亭科學儀器廠;全溫立式振蕩培養箱:太倉市實驗設備廠;722N紫外可見分光光度計:上海精密科學儀器廠;HH-4數顯恒溫水浴鍋:國華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 斜面培養

將保藏的枯草芽孢菌種接入基礎培養基 (牛肉膏 0.3 g/100 mL,蛋白胨 1 g/100 mL,氯化鈉 0.5 g/100 mL,瓊脂 2.5 g/100 mL),在 30℃下進行恒溫靜止培養 24 h,使其轉接活化。

1.3.2 種子培養

挑取 2環枯草芽孢桿菌種子培養基活化后菌株,接入裝有 100 mL種子培養基 (牛肉膏 0.3 g/100 mL,蛋白胨 1 g/100 mL,氯化鈉 0.5 g/100 mL)的250 mL錐形瓶中,8層紗布封口,在恒溫振蕩培養箱中進行擴大培養,控制溫度 30℃,轉速 180 r/min,培養 24 h,使其菌體濃度達到 108個 /mL。

1.3.3 發酵培養

從已制備好的種子培養基中取出一定體積的菌懸液接入已滅菌的裝有 100 mL發酵培養基 (磷酸二氫鉀 0.45 g/100 mL,葡萄糖 0.8 g/100 mL,料液比1∶23)的 250 mL錐形瓶中進行液態發酵,發酵錐形瓶用 8層紗布封口,控制在 38℃,180 r/min的恒溫振蕩培養箱內進行培養,培養一定時間后取樣進行測定。

1.3.4 發酵液處理

將培養一定時間的發酵產物取出,2～4℃下4 000×g離心 15 min,測定其上清液體積,用 0.45 μm微孔濾膜過濾上清液,除去不溶物和細菌,備用。

1.3.5 枯草芽孢桿菌生長曲線的測定

從活化后的枯草芽孢桿菌斜面上挑取 2環接入液體種子培養基中,控制培養溫度 30℃,轉速 180 r/min,每隔 2 h取一次樣 (5 mL),高速離心下沉淀菌體 (4 000×g,15 min),去除上清液后,菌體沉淀以無菌蒸餾水懸浮,混勻定容至 10 mL,于 600 nm處測定其吸光度。

1.3.6 細菌數量測定

血球板計數法測定[8]。

1.3.7 菜籽多肽得率測定

參照文獻[9]所述方法,取 2.5 mL處理液,加入等體積 10%的三氯乙酸 (TCA),靜置 30 min,2～4℃下,5 000×g離心 20 min,取 2 mL上清液,加 8 mL雙縮脲試劑,25℃下靜置 30 min,測 OD540值。肽得率按公式 (1)計算:

1.3.8 ACE抑制活性的測定

ACE抑制活性的測定參照 Cushman等[10]的方法,做出適當的修改,具體步驟如下:用含有 0.3 mol/L NaCl的 0.1 mol/L硼酸鹽緩沖液 (pH 8.3)將 HHL配制成 5.0 mmol/L的溶液。取 100μL的 HHL和40μL的水解產物混合,于 37℃下保溫 3 min后,加入 10μL ACE(溶于蒸餾水,活力為 0.1 U/mL),混勻后 37℃保溫 30 min,再加入 250μL的 1 mol/L的HCl溶液以終止反應,再加入 1.7 mL醋酸乙酯,15 s振蕩混勻,5 000×g離心 10 min,用移液管吸取1 mol/L醋酸乙酯層,真空冷凍干燥 2 h后,加入 3 mL蒸餾水,在 228 nm處測定其吸光度。ACE抑制活性按公式 (2)計算:

式中:A為含有菜籽多肽液和 ACE溶液時所測的吸光度;B為不含有菜籽多肽液,但含有 ACE溶液時所測的吸光度;C為含有菜籽多肽液,但不含 ACE溶液時所測的吸光度。

2 結果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌生長曲線

枯草芽孢桿菌生長繁殖比較快,在適宜條件下,20～30 min就可以分裂一次,從圖 1可以看到,在發酵的開始階段,菌體數目增加并不多 (0～10 h),一定時間后,菌體數目增長很快 (12～28 h),隨后菌體增長進入穩定期 (24～32 h),在 34 h后,隨著菌體數目增長,培養基內營養物質的消耗和自身代謝產物的大量產生,菌體進入衰亡期。因此,12～28 h是本菌株的對數期,由于對數期的微生物細胞生長平衡,菌體內酶系活躍,代謝旺盛,群體的形態與生理特征最一致,并且抗不良環境的能力強,所以在試驗中,均以培養 20 h左右的菌株為種子液。

圖 1 枯草芽孢桿菌生長曲線圖

2.2 肽含量標準曲線

用 5%TCA配制不同濃度的 Gly-Gly-Tyr-Arg標準溶液,按照多肽含量測定方法顯色,于 540 nm下測定OD值。以多肽質量為橫坐標 x(mg),OD值為縱坐標 y,制作標準曲線 (圖 2),得到回歸方程y=0.025 7x+0.002 9,R2=0.999 5。

圖 2 Gly-Gly-Tyr-Arg四肽標準曲線

2.3 搖床轉速對液態發酵肽得率和 ACE抑制率的影響

在液態發酵當中,搖床的轉速會影響液態發酵培養基的通氣量,使得培養基中溶氧量變化,從而影響菌種的生長和發酵。由圖 3可以看出,搖床轉速對液態發酵的影響不是很明顯,ACE抑制活性極差為 0.6%。這可能是由于液態發酵時液態培養基接觸空氣的面積較大,且處于不斷震蕩當中,培養基的溶氧充足,在較低轉速下即可滿足微生物生長對氧氣的需求,因此,當轉速改變,對發酵結果的影響不是很明顯,當搖床轉速達到 180 r/min時,為液態發酵的最優轉速,肽得率可以達到 23.19%,ACE抑制活性達到 62.08%。

圖 3 搖床轉速對肽得率和ACE抑制活性的影響

2.4 接種量對液態發酵肽得率和 ACE抑制率的影響

由圖 4可以看出,接入枯草芽孢桿菌的量對液態發酵會產生一定的影響,當接種量過少,產生的蛋白酶量會較少,從而使得肽得率較少,ACE抑制活性較低,而接種量過多,培養基中的營養物質不能完全滿足枯草芽孢桿菌的生長需要,也會使得枯草芽孢桿菌生長受到限制,導致發酵效果不佳。當接種量達到 1×108個 /mL時,肽得率和 ACE抑制活性均達到最高值,再增加接種量,會導致肽得率的明顯降低,因此,液態發酵培養基的接種量為 1×108個 /mL。

圖 4 接種量對肽得率和ACE抑制活性的影響

2.5 發酵溫度對液態發酵肽得率和 ACE抑制率的影響

溫度是影響微生物生長繁殖以及產酶的主要因素之一,因此,在液態發酵中,對發酵溫度的控制十分關鍵。由圖 5可以看出,溫度過低和過高都不利于枯草芽孢桿菌液態發酵。當溫度過低,枯草芽孢桿菌生長不佳,產酶量也較少,而溫度過高,會抑制其生長,甚至導致其死亡。當發酵溫度在 38℃時,菜籽肽得率和 ACE抑制活性均達到最大值,分別為23.36%和 62.47%,因此,液態發酵的最優溫度條件為 38℃。

圖 5 發酵溫度對肽得率和ACE抑制活性的影響

2.6 發酵時間對液態發酵肽得率和 ACE抑制率的影響

由圖 6可以看出,發酵時間對液態指標有顯著的影響。當發酵進行到 24 h時,肽得率和 ACE抑制活性均達到最高值,而隨著發酵時間的延長,肽得率和ACE抑制活性逐步降低,推測其原因是由于隨著發酵的進行,已經得到的小肽進一步水解,從而肽得率明顯降低,而隨著小肽的水解,一些具有 ACE抑制活性的小肽也被進一步的水解成為了不具有ACE抑制活性的短肽或氨基酸,因此,ACE抑制活性也隨著發酵時間的延長而逐步降低。因此,液態發酵的最優時間為 24 h,此時的肽得率和 ACE抑制活性均為最高,分別為 23.85%和 64.38%。

圖 6 發酵時間對肽得率和ACE抑制活性的影響

2.6 響應面分析法優化發酵條件結果分析

2.6.1 響應面分析法分析因素的選取及試驗結果

在單因子試驗結果基礎上,根據 Box-Behnken的中心組合設計原理,對液態發酵影響較大的 3個因素設計響應曲面試驗以確定最優的培養基條件。以菜籽肽 ACE抑制率為響應值,自變量為發酵時間,發酵溫度和接種量,分別以 X1、X2和 X3代表,按方程 xi=(Xi-X0)/ΔX對自變量進行編碼,其中,xi為自變量的編碼值,Xi為自變量的真實值,X0為試驗中心點處自變量的真實值,ΔX為自變量的變化步長。因子編碼及各自變量水平見表 1。

為了最優擬合多元二次模型方程各項系數,依據統計學實驗設計要求,對影響菜籽肽得率的發酵培養基關鍵內在因素進行了 15組試驗,15組試驗分為析因點和零點,試驗號 1～12是析因試驗,13～15是中心試驗。其中析因點為自變量取值在 x1,x2,x3所構成的三維定點,零點區域為中心點,零點試驗重復 3次,以估計試驗誤差,試驗結果見表 2。

利用Designexpert軟件對表試驗數據進行多元回歸擬合,獲得枯草芽孢桿菌液態發酵菜籽產 ACE抑制肽發酵條件編碼自變量的二次多項回歸方程為:

其中 Y為 ACE抑制率,X1、X2、X3分別代表發酵時間,發酵溫度和接種量。方程中 X1,X2的系數均較大,表明發酵時間和發酵溫度對 ACE抑制效率最具有顯著意義。一次項,二次項和交互項系數大多為負值,可以認為一次項,二次項和交互項方程主要對ACE抑制率起負作用。

從該模型的方差分析表 3可見,試驗所選用的二次多項模型具有高度的顯著性 (P=0.001 9),P值越小,其因子越顯著。失擬項在 a=0.05水平上不顯著 (P=0.120 0>0.05),其校正決定系數為0.927 2,表明此模型擬合優度好,ACE抑制率僅有7.28%的總變異不能由此模型進行解釋。

對上述方程的回歸系數顯著性檢驗表明 (見表4),發酵時間對 ACE抑制率的影響極顯著 (P<0.01),發酵溫度對 ACE抑制率的影響顯著 (P<0.5),表明在發酵培養基中,發酵溫度和發酵時間對ACE抑制率有顯著影響;3個因素之間的交互作用影響也都顯著,說明在培養基中,發酵時間,發酵溫度和接種量之間的交互作用亦能對ACE得率造成顯著影響。通過顯著性檢驗可以看出,發酵時間對菜籽肽得率的影響最大,發酵溫度的影響次之,接種量的影響在本試驗范圍內最小。

表 1 Box-Behnken中心組合試驗設計因素水平及編碼

表 2 Box-Behnken試驗設計及菜籽肽得率實測值及預測值

表 3 菜籽肽得率二次多項模型方差分析表

表 4 菜籽肽得率回歸方程系數顯著檢驗

2.6.2 ACE抑制率的響應面分析與優化

模型的響應面圖及其等高線圖可比較直觀地解釋各變量和變量之間對響應值的影響。等高線圖還可揭示出各變量之間交互作用的顯著性。在接種量保持固定的情況下,發酵時間 (A)和發酵溫度 (B)對ACE抑制活性影響交互作用的等高線圖和曲面圖如圖 7所示,發酵溫度 (B)和接種量 (C)對 ACE抑制活性影響交互作用的等高線圖和曲面圖如圖 8所示。

通過圖 7可以對發酵時間和溫度交互影響 ACE抑制活性的效應進行分析和評價,并從中確定最佳的因素水平范圍。由圖 7可以看出,當發酵時間在12～22.8 h,發酵溫度在 37.5～38.8℃,ACE抑制率高于 70%。

通過圖 8可以對發酵溫度和接種量交互影響ACE抑制活性的效應進行分析和評價,并從中確定最佳的因素水平范圍。由圖 8可以看出,當發酵溫度在 37.5～38.4℃接種量在 0.6×108～2×108個 /mL,ACE抑制率高于 70%。

2.6.3 液態發酵生產ACE抑制肽最優條件的確立

從圖 7、圖 8中可以看出 X1、X2、X3存在極值點,為了進一步驗證最佳點的值,對回歸方程 (3)取一階偏導等于零并整理得:-2.07-1.98X2+0.6X3-3.88X1=0;-0.63-1.98X1-2.69X3-10.9X2=0;0.17+0.6X1-2.69X2-11.74X3=0,解得 X1=-0.57、X2=0.05、X3=-0.03。代入回歸方程 (3),解得預測的最高ACE抑制率為 70.95%。轉換后得到最佳培養基配比為發酵時間 19.2 h,發酵溫度38.1℃,接種量 1×108個 /mL。為了方便培養基的配制,確定培養基的最優配方為:發酵時間 20 h,發酵溫度38℃,接種量 1×108個 /mL。

2.6.4 模型驗證試驗

根據 Box-Behilken試驗所得的結果和二次多項回歸方程,利用 Designexpert軟件獲得了 ACE抑制活性最高時的最佳工藝條件。為了驗證其優化結果的可靠性,在最佳發酵培養基中進行 5組平行試驗,所得ACE抑制活性分別 70.08%、71.53%、71.14%、70.69%、69.95%,平均值為 70.68%,回歸方程所得到的ACE抑制活性預測值與驗證試驗的平均值相接近,說明該模型能夠較好地預測 ACE抑制活性值。

3 結論

以ACE抑制率為考察指標,經單因素試驗確定發酵時間,發酵溫度和接種量對 ACE抑制率有顯著影響,在此基礎上,采用響應面分析方法,根據 Box-Behnken中心組合原理設計了 3因素 3水平試驗,用Design-Expert軟件處理試驗數據,得到了一個 ACE抑制率回歸模型以及取得模型最優值時各因素水平。試驗結果表明,枯草芽孢桿菌液態發酵中發酵時間,發酵溫度和接種量的最佳工藝條件分別為20 h、38℃和 1×108個 /mL,在該最佳工藝條件下,ACE抑制率可達 70.95%。在枯草芽孢桿菌液態發酵培養基優化的基礎上,ACE抑制率又提高了大約2%。綜合枯草芽孢桿菌液態發酵菜籽粕生產 ACE抑制肽的培養基優化結果和發酵條件優化結果,可以得出其最佳發酵條件為:磷酸二氫鉀 0.45%,葡萄糖 0.8%,料液比 1∶23,初始 pH7,搖床轉速 180 r/min,發酵時間 20 h,發酵溫度 38℃,接種量 1×108個 /mL,在此基礎上,ACE抑制活性可達 70.95%。

微生物作為酶制劑的重要來源,采用液態發酵法制備 ACE抑制肽,可以很好的節約成本,為工業化大規模生產菜籽 ACE抑制肽提供一條可行的途徑,同時,還可以通過液態發酵的方法將脫苦和制肽一步完成,通過絮凝劑將微生物沉淀,并聯用多種分離純化技術,可以制得高純度的ACE抑制肽。

菜籽 ACE抑制肽可以廣泛的運用到食品,醫療行業,具有很高的利用價值,本試驗運用枯草芽孢桿菌液態發酵法制備菜籽 ACE抑制肽具有生產成本低、肽得率高、ACE抑制率高等特點,在工業化生產菜籽ACE抑制肽上是很有潛力的方法。

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Opti mization ofLiquid Fer mentation for Producing Rapeseed Angiotensin I-Converting Enzyme Inhibitory Peptides

Ju Xingrong1Jin Jing1Wang Lifeng1,2Yuan Jian1He Rong1,2
(College of Food Science and Engineering,NanjingUniversity of Finance&Economics,Key Laboratory of Grain&OilsQuality Control and Deep-Utilizing Technology of Jiangsu Province1,Nanjing 210003)
(School of Food Science and Technology,Jiangnan University2,Wuxi 214122)

Rapeseed mealwas used to produce angiotensin I-converting enzyme(ACE)inhibitory peptides withB acillus subtilisliquid-state fermentation.W ith rapeseed peptide yield and ACE inhibitory rate as indexes for single factor test,the technology conditions for producingACE inhibitory peptideswere optimized by response surface analysis.Results:The optimal conditions are fer mentation ti me 20 h,fer mentation temperature 38℃,and inoculum size 1×108ind/mL.Under the above conditions,the ACE inhibitory rate reaches 70.95%.

Bacillus subtilis,rapeseed peptide,liquid-state fermentation,ACE inhibitory peptides,response surface methodology

TS209

A

1003-0174(2011)01-0096-06

863計劃(2007AA10Z331),國家農業成果轉化資金項目(2009C10045),江蘇省自然科學基金項目,江蘇省農業科技自主創新資金項目[cx(10)444]

2010-01-11

鞠興榮,男,1957年出生,教授,博士,食品營養及功能性成分研究與開發