冬蟲夏草對慢性阻塞性肺疾病大鼠樹突狀細胞功能的影響*

李洪濤, 張天托△, 黃 靜, 劉 慧, 川上和羲

(1中山大學附屬第三醫院呼吸內科， 廣東 廣州 510630；2日本東北大學醫學部，日本 仙臺 980-8575)

冬蟲夏草對慢性阻塞性肺疾病大鼠樹突狀細胞功能的影響*

李洪濤1, 張天托1△, 黃 靜1, 劉 慧1, 川上和羲2

(1中山大學附屬第三醫院呼吸內科， 廣東 廣州 510630；2日本東北大學醫學部，日本 仙臺 980-8575)

目的： 研究冬蟲夏草對慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠樹突狀細胞(DCs)功能的影響及其分子機制。方法將大鼠隨機分為COPD模型組、冬蟲夏草治療組和正常對照組，觀察各組大鼠氣道病理改變，分離培養鼠DCs，ELISA法檢測DCs培養上清液和DCs-T細胞共培養上清液中細胞因子含量。結果與正常對照組相比，COPD模型組和冬蟲夏草治療組的平均肺泡計數減少(Plt;0.05)，冬蟲夏草治療組高于COPD模型組，但差異無統計學意義(Pgt;0.05)。冬蟲夏草治療組DCs-T細胞共培養后上清液中IFN-γ水平高于COPD模型組和正常對照組(Plt;0.05)，IL-5水平各組無顯著差異(Pgt;0.05)。冬蟲夏草治療組DCs上清液中TNF-α和IL-12 p70水平高于COPD模型組和正常對照組(Plt;0.05)。結論冬蟲夏草可促使COPD大鼠DCs產生Th1型細胞因子，機制可能與DCs產生的IL-12 p70促進T細胞產生IFN-γ有關。

肺疾病，慢性阻塞性； 冬蟲夏草； 樹突狀細胞

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)本質是慢性氣道非特異性炎癥性疾病，吸煙是COPD發病的獨立危險因素。中醫認為COPD屬“喘癥”范疇，肺腎兩虛是COPD的主要發病機制。《本草從新》中記述：“蟲草性味甘平，入肺、腎二經，保肺益腎，止血化痰，已勞嗽”。 長期臨床實踐證實冬蟲夏草(Cordycepssinensis)對緩解COPD癥狀，減少發作次數，改善生活質量等方面有一定作用。但冬蟲夏草對COPD的作用機制尚有待闡明。新近我們研究發現冬蟲夏草可通過樹突狀細胞(dendritic cells, DCs)調節免疫反應[1]，但冬蟲夏草對COPD的免疫調節能否通過影響DCs尚不清楚。本研究采取大鼠被動吸煙的方法建立COPD模型，通過冬蟲夏草喂養COPD大鼠，觀察冬蟲夏草對慢性阻塞性肺疾病模型DCs功能的影響，以探討冬蟲夏草防治COPD的作用機制。

材 料 和 方 法

1動物模型制作及實驗分組

參照管彩虹等[2]的方法稍加修改： SD大鼠18只，體重(202±25)g，鼠齡12周，隨機分組：COPD模型組、冬蟲夏草治療組、正常對照組，每組6只。(1)COPD模型組：在自制染毒箱中，每次被動吸煙10支(廣東中煙工業有限責任公司羊城牌香煙，焦油量13 mg/支，煙堿量1.2 mg/支)，每天2次，每次持續30 min，共8周。(2)冬蟲夏草治療組：在COPD模型制備的基礎上胃飼5 mL冬蟲夏草菌粉溶液(5 g/kg)(杭州眾生菌蕈生物技術有限公司)。(3)正常對照組：每天呼吸正常空氣。COPD模型組和正常對照組每天胃飼5 mL的生理鹽水(NS)。各組動物飼養于SPF級中山大學實驗動物中心。8周末從各組中隨機取1只大鼠，斷頸處死取右肺中葉進行肺組織HE染色。肺組織切片在100倍光鏡下觀察，對每組5張切片連續計數3個視野內和十字線相交的肺泡數，除以3后得平均肺泡計數。

2試劑

鼠粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)、鼠白細胞介素-4(interleukin-4,IL-4)購自PeproTech；IL-2購自深圳科興生物工程有限公司；FITC-CD83購自eBioscience；FITC標記的鼠IgG同型對照抗體購自eBioscience；DCs完全培養基包括RPMI-1640(Gibco)，10%胎牛血清(杭州四季青公司)，2 mmol/L L-谷氨酰胺，10 mmol/L Hepes, 1×105U/L青霉素，1×105U/L鏈霉素；淋巴細胞分離液購自上海生化二廠；白細胞介素-5(interleukin-5, IL-5)、干擾素-γ(interferon-gamma, IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)和白細胞介素-12 p70 (interleukin-12 p70, IL-12 p70)的ELISA試劑盒購自深圳達科為生物科技有限公司。

3DCs的分離、培養與鑒定

(1) 細胞準備：8周末從各組中取5只大鼠，水合氯醛腹腔麻醉，抽取肝素抗凝的右心房血8～10 mL，PBS緩沖液稀釋全血1倍并混勻。將混勻的全血輕輕置于淋巴細胞分離液上，2 000 r/min離心20 min，毛細吸管吸出中間的白膜層細胞，用RPMI-1640培養液洗滌，獲得單個核細胞。(2)DCs體外誘導和培養：DCs的分離和培養參照我們前期研究[3-4]。將獲得的單個核細胞，用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養液調節細胞濃度為1×109/L，加入6孔塑料培養板中(3 mL/well)，5%CO2、37 ℃培養2 h，用37 ℃預溫的RPMI-1640培養液輕輕洗出非黏附細胞。然后在貼壁細胞中用RPMI-1640培養液培養，并在培養板中加入含GM-CSF 和IL-4等細胞因子，隔天半量換液，繼續培養共8 d。相差倒置顯微鏡每天觀察細胞生長及形態變化情況。調整成熟DCs濃度為2×108/L，加入Eppendorf管，每管25 μL，然后加入FITC-CD83單抗5 μL，FITC標記的鼠IgG1作為同型對照，4 ℃冰箱中避光反應30 min，預冷的PBS洗2遍，1%多聚甲醛固定后，流式細胞儀以488 nm激發光檢測，至少采集10 000個細胞，以CellQuest和WinMDI軟件分析，測定DCs的表型CD83。

4DCs培養上清液和DCs-T細胞共培養上清液中細胞因子含量測定

取DCs培養第8 d上清液，分別按TNF-α、IL-12 p70酶聯免疫試劑盒說明書介紹的方法測定上清液中TNF-α、IL-12 p70的含量。收獲各組成熟DCs和IL-2 2×105U/L培養的T淋巴細胞(采用尼龍毛柱法分離大鼠脾臟T淋巴細胞)。分別將5×105T細胞和5×104DCs加入6孔板共培養，培養72 h后收集培養上清液-70 ℃冰箱保存待測。應用抗體夾心ELISA法檢測其IL-5和IFN-γ水平。取3復孔平均值。ELISA檢測按操作說明書進行。

5統計學處理

結 果

1肺組織切片和平均肺泡計數

COPD模型組肺組織具有COPD病理形態學改變：支氣管上皮細胞脫落，纖毛倒伏、黏連，杯狀細胞增生，部分肺泡壁破壞、融合，細支氣管壁及周圍組織有淋巴細胞、中性粒細胞、漿細胞浸潤。冬蟲夏草治療組上述病理改變較模型組減輕。正常對照組大鼠的肺泡結構正常，病理改變見圖1。與正常對照組(62±8)相比，COPD模型組(38±16)、冬蟲夏草治療組(48±9)的平均肺泡計數減少(n=5，Plt;0.05)，冬蟲夏草治療組高于COPD模型組，但差異無統計學意義(n= 5，Pgt;0.05)。

Figure 1. Histology of lung tissues from the three groups (HE staining,×100). A:control;B:COPD;C:Cordyceps sinensis.

2各組DCs分泌細胞因子的變化

ELISA檢測各組DCs培養上清液中細胞因子含量結果見表1：冬蟲夏草治療組DCs上清液中TNF-α和IL-12 p70水平高于COPD模型組和正常對照組，差異顯著(Plt;0.05)。

3各組DCs-T細胞共培養上清液中細胞因子的變化

DCs的相差顯微鏡示有毛刺狀突起，流式細胞儀表型檢測示CD83陽性，符合我們以往研究[3-4]。各組DCs與同種自體T細胞共培養72 h，ELISA檢測培養上清液中細胞因子含量見表2：冬蟲夏草治療組DCs-T細胞共培養后上清液中IFN-γ水平高于COPD模型組和正常對照組，差異顯著(Plt;0.05)；而IL-5水平各組無顯著差異(Pgt;0.05)。

表1 各組DCs細胞上清液細胞因子變化

討 論

鑒于吸煙是發生COPD的獨立危險因素，本實驗采用給大鼠反復被動吸煙的方法建立COPD模型符合人類COPD發生發展的自然過程，本實驗動物模型的肺組織形態(見圖1)符合慢性支氣管炎阻塞性肺氣腫特征，可用于COPD的實驗研究。平均肺泡計數是衡量肺泡密度的標志。本研究發現，冬蟲夏草治療組平均肺泡計數雖然低于對照組，但比COPD模型組平均肺泡計數增加，說明冬蟲夏草雖然不能阻止COPD的形成，但在一定程度上能有效抑制其肺泡的破壞，這對COPD的防治有積極作用。冬蟲夏草屬肉座菌目麥角菌科蟲草屬植物，為蟲草菌的子座與其寄生蝙蝠蛾幼蟲尸體的復合物。冬蟲夏草始載于清，其具有補肺益腎、止咳化痰之效，用于久咳虛喘、勞嗽痰血等。冬蟲夏草具有增強機體免疫力、抗炎、抗氧化及舒張支氣管平滑肌等作用[5-6]。

表2 各組DCs-T細胞共培養后上清液細胞因子變化

冬蟲夏草可通過激活巨噬細胞和DCs以調節各類免疫反應，并抑制LPS誘導的DCs激活[7-8]。Li等研究發現冬蟲夏草在無炎癥環境下，可促使DCs趨向于Th1型免疫反應，在炎癥環境下，則由Th1型免疫反應轉向為Th2型免疫反應[8]，表明冬蟲夏草可通過DCs調節Th1/Th2平衡。2010年我們的一項前期研究中，通過基因敲除鼠及熒光報告分析發現冬蟲夏草能激活鼠骨髓來源的DCs釋放IL-12 p40、TNF-α并表達CD40而發揮免疫調節作用，從而進一步說明了冬蟲夏草通過DCs調節Th1/Th2平衡的具體分子機制[1]。

然而，冬蟲夏草對COPD的免疫調節能否通過影響DCs尚有待研究。本研究表明冬蟲夏草治療組DCs-T細胞共培養后上清液中IFN-γ水平高于COPD模型組和正常對照組(Plt;0.05)，且冬蟲夏草治療組DCs上清液中TNF-α和IL-12 p70水平高于COPD模型組和正常對照組(Plt;0.05)，表明冬蟲夏草可促使COPD模型DCs產生Th1型細胞因子，其機制可能與冬蟲夏草干預后，COPD模型DCs產生IL-12，IL-12促使T細胞產生Th1型細胞因子IFN-γ有關。而且，DCs分泌的促炎性細胞因子TNF-α也參與到免疫反應中。本研究提示冬蟲夏草對COPD大鼠模型有抑制作用，與冬蟲夏草促使DCs產生Th1型細胞因子，調節Th1/Th2平衡有關，從而為臨床防治提供了一定的理論依據。

[1]Xiao G, Miyazato A, Abe Y, et al. Activation of myeloid dendritic cells by deoxynucleic acids fromCordycepssinensisvia a Toll-like receptor 9-dependent pathway[J]. Cell Immunol,2010,263(2):241-250.

[2]管彩虹,劉 進.冬蟲夏草對慢性阻塞性肺病模型大鼠的氣道炎癥和肺功能的影響[J].浙江醫學,2007,29(2):186-188.

[3]李洪濤,黃 瑾. 人外周血樹突狀細胞培養和地塞米松對其分化的影響作用[J].中國免疫學雜志,2007,23(4):360-363.

[4]李洪濤,黃 瑾,張天托. 激素預處理樹突狀細胞對哮喘Th2反應的影響[J].中國病理生理雜志,2009,25(10):1983-1987.

[5]Dong CH, Yao YJ.Invitroevaluation of antioxidant activities of aqueous extracts from natural and cultured mycelia ofCordycepssinensis[J]. LWT - Food Sci Technol,2008, 41(4): 669-677.

[6]Zhou X, Luo L, Dressel W, et al. Cordycepin is an immunoregulatory active ingredient ofCordycepssinensis[J]. Am J Chin Med,2008,36(5):967-980.

[7]Kuo YC, Tsai WJ, Wang JY, et al. Regulation of bronchoalveolar lavage fluids cell function by the immunomodulatory agents fromCordycepssinensis[J]. Life Sci, 2001,68(9):1067-1082.

[8]Li CY, Chiang CS, Tsai ML, et al. Two-sided effect ofCordycepssinensison dendritic cells in different physiological stages[J]. J Leukoc Biol, 2009, 85(6): 987-995.

在小鼠全身炎癥反應中PGC-1α促進急性腎損傷恢復的作用

敗血癥相關急性腎損傷(AKI)是一種常見的疾病狀態，與典型缺血性腎損傷的區別是腎小管細胞死亡的病變較輕。美國科學家最近在小鼠中的研究發現，內毒素血癥能減少氧氣運輸到腎，但并不明顯改變腎組織中的氧含量，提示腎細胞的耗氧量降低，并有腎小管線粒體腫脹和功能受損。基因表達譜顯示敗血癥相關急性腎損傷時，與氧化磷酸化有關的基因被選擇性地抑制，當腎小球功能恢復正常時這些基因可再度被激活。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)輔激活蛋白-1α(PGC-1α)是線粒體生物轉化和新陳代謝的主要調節物，其活性與上述模式相符，而且受抑制程度也和AKI的程度而相對應。此外，在腫瘤壞死因子 γ(TNF-γ)的作用下，腎小管細胞下調PGC-1α的表達，降低耗氧量。然而，過量的PGC-1α與后者的作用相反。腎小球或腎小管部位特異性PGC-1α基因敲除的小鼠都能維持正常的基礎腎功能，但內毒素血癥能使這些小鼠的腎功能持續受損。以上結果提示，誘導PGC-1α的生成可能對恢復敗血癥相關急性腎損傷的腎功能有利。

J Clin Invest, 2011,121(10): 4003-4014(唐清亮)

InfluenceofCordycepssinensisoncytokineprofileofdendriticcellsinchronicobstructivepulmonaryratmodel

LI Hong-tao1, ZHANG Tian-tuo1, HUANG Jing1, LIU Hui1, KAWAKAMI Kazuyoshi2

(1DepartmentofRespiratoryMedicine,ThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China;2SchoolofMedicine,TohokuUniversity,Sendai980-8575,Japan.E-mail:zhtituli@163.com)

AIM: To investigate the effect ofCordycepssinensis(CS) on dendritic cells (DCs) in the rat model of chronic obstructive pulmonary disease (COPD).METHODSEighteen Sprague-Dawley male rats were randomly divided into 3 groups: control group, COPD group and CS group.The rats in the latter 2 groups were exposed to cigarette smoking for 8 weeks with (CS group) or without (COPD group) CS treatment. The rats in control group were maintained under normal condition. After 8 weeks,the histological changes of the right lung were observed under microscope. The DCs from the 3 groups were harvested and the supernatants of DCs were analyzed for the levels of TNF-α and IL-12 p70 by commercially available ELISA kit. The DCs were then washed and coculturedinvitrowith autologous T cells purified by a nylon cotton column. The supernatants of DCs-T coculture were collected after 72 h incubation, and analyzed for the levels of interleukin-5 (IL-5) and interferon-γ (IFN-γ) by ELISA.RESULTSAnalysis of the rat lung parenchyma revealed a significant decrease in the mean alveolar number, an indicator of alveolar density, in COPD group (38±16) and CS group (48±9) in comparison with control group (62±8). The mean alveolar number tended to be increased in CS group than that in COPD group, although this difference did not achieve statistical significance (Pgt;0.05). The concentrations of TNF-α and IL-12 p70 in the culture supernatants of DCs and IFN-γ in the supernatants of DCs-T cocluture were up-regulated in CS group as compared with those in COPD group and control group (Plt;0.05). The level of IL-5 in the DCs-T coculture supernatants of the 3 groups did not show differences with statistical significance (Pgt;0.05).CONCLUSIONThe therapeutic effects of CS on COPD rats may be related to modulation of Th1 and Th2 cell functions. This effect is probably mediated through IL-12 p70 produced by DCs and Th1 cytokine IFN-γ produced by autologous T cells.

Pulmonary disease,chronic obstructive; Cordyceps sinensis; Dendritic cells

1000-4718(2011)12-2372-04

R563.3

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.12.025

2011-07-27

2011-10-17

廣東省中醫藥局基金資助項目(No. 2009156)；廣東省醫學科學基金資助項目(No. A2009194)

△通訊作者 Tel: 020-85252241; E-mail: zhtituli@163.com