HPLC法測定健肝顆粒中綿茵陳成分綠原酸的含量

周淑群 李明艷 周定球

HPLC法測定健肝顆粒中綿茵陳成分綠原酸的含量

周淑群 李明艷 周定球

目的 建立健肝顆粒中綠原酸的含量測定方法。方法 采用高效液相色譜法,色譜條件：Diamonsil-C18柱 (250 mm ×4.6 mm,5um);流動相為乙腈 -0.4磷酸溶液 (20：80);流速 0.8 ml/min;檢測波長 336nm;柱溫 30℃。結果 綠原酸在 9.03～180.6ug/ml范圍內,其峰面積值與進樣量有良好的線性關系,r=0.9995,平均加樣回收率為 99.7%,RSD為 0.71%。結論 該測定方法快速簡便,重現性好,可用于健肝顆粒的質量控制。

健肝顆粒;綠原酸;HPLC

健肝顆粒是由甘草、黃花母、蝦鉗草、黃鱔藤、田基黃、綿茵陳,六味中藥制成的制劑,用于治療急、慢性肝炎。為了有效控制該制劑的質量,本文參照有關文獻[1,2],建立高效液相色譜法測定其中綠原酸含量的方法,結果顯示該方法簡便,精密度好,重復性好,可用于本制劑的質量控制?，F介紹如下。

1 儀器和試藥

日本島津 LC-10AT高效液相色譜儀,SPD-10A檢測器,CLASS-VP 6.12 SPI色譜數據系統,UV-24010PC紫外分光光度計(日本島津),北京賽多利斯 BP211D電子分析天平,0412-1離心機,B2500S-MT超聲波清洗機。綠原酸對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號：110753-200413)乙腈、甲醇均為色譜純,水為注射用水。健肝顆粒劑由本院生產 (批號 ：110104,110107,110112)。

2 處方與制備

取甘草 25 g,黃花母 100 g,蝦鉗草 100 g,黃鱔藤 100 g,田基黃 100 g,綿茵陳 100 g,尼泊金 0.5 g,總制成 100 g。將上述藥材加水浸泡 24 h,煎煮兩次,每次 1 h,除藥渣后濃縮成流浸膏 (相對密度 1.2),加蔗糖粉 (過 40目篩),制軟材、制粒、干燥、整粒,即得。

圖 1 健肝顆粒的 HPLC圖

3 方法與結果

3.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil-C18柱 (250 mm×4.6 mm,5um),流動相：乙腈-0.4%磷酸溶液 (20∶80),流速 0.8 ml/min,檢測波長 336nm,柱溫 30℃,進樣量 20μl。在此色譜條件下,添加劑無干擾。色譜圖見圖 1。由圖可見,在此色譜條件下,綠原酸的保留時間為 7.9 min出峰良好,無干擾。

3.2 溶液的制備

3.2.1 標準品溶液 精密稱取綠原酸對照品適量,加 50%甲醇溶解、稀釋、定容,制成 1.806 mg/ml的儲備液。

3.2.2 供試品溶液 取供試品約 1 g,研成細粉,精密稱定,置 25 ml棕色容量瓶中,加 50%甲醇定容,搖勻,超聲 30 min后取出,放至室溫,定容,搖勻,取 5 ml離心,取上清液用針式過濾器過濾,進樣。

3.2.3 陰性樣品溶液 除綿茵陳外,其余各藥按處方比例依工藝制成陰性樣品,再按供試品溶液制備方法,制得陰性供試品溶液。

3.3 系統適用性實驗

分別精密吸取對照品、供試品溶液、陰性對照品溶液,在上述色譜條件下進樣,記錄色譜圖,結果綠原酸色譜峰與其他雜質峰得到較好的分離,分離度均大于1.5,陰性對照無干擾,色譜圖見圖 1。

3.4 線性關系

分別精密量取綠原酸對照品貯備液 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml置 10 ml容量瓶中 ,用甲醇稀釋到刻度線制成對照品溶液,分別進樣,以濃度為橫坐標 (X),峰面積為縱坐標 (Y),進行線性回歸,得綠原酸的標準曲線為 y=70900x+62527(n=6,r=0.9995),線性范圍是 9.03～180.6ug。

3.5 回收率試驗

取 6份已知含量的樣品適量,加入一定含量的對照品溶液,按“供試品溶液的制備”項下處理,在上述色譜條件下,測定加樣回收供試品溶液中綠原酸的含量。計算綠原酸加回收率,結果見表 1。

表 1 綠原酸的加樣回收率試驗結果 (n=6)

3.6 精密度試驗

取一份中間濃度的對照品溶液,分別進樣 6次,測得綠原酸的峰面積 RSD為 0.74%。

3.7 穩定性試驗

取一份樣品,按“供試品溶液的制備”項下制備,分別在 0,1,2,3,4,5 h依法測定,記錄色譜峰的峰面積,綠原酸的 RSD為 0.27%。表明供試品溶液在 5 h內穩定。

3.8 重復性試驗

取同一批樣品 6份,分別按“供試品溶液的制備”項下制備,測定峰面積,計算含量,綠原酸的 RSD為1.96%,結果表明重復性良好。

3.9 樣品含量測定

取三份樣品,分別按“供試品溶液的制備”項下操作,測得其中綠原酸含量分別為 0.4061 mg/g、0.4056 mg/g、0.4059 mg/g。

4 討論

4.1 本法根據健肝顆粒中綿茵陳成分綠原酸的紫外光譜選定 336 nm作為測定波長;而選用乙腈-0.4%磷酸溶液 (20：80)作為流動相,可使基線更加平穩,在 7.9 min出峰,峰形好,分離效果也好在選定的色譜條件下,可排除其他成分的干擾。本實驗采用甲醇與樣品溶液體積比為 5：5進行提取綠原酸,獲得較好的效果。本法用于檢測健肝顆粒中綿茵陳成分綠原酸的含量結果準確可靠。

4.2 健肝顆粒由中藥綿茵陳、田基黃、甘草等組成,該方具有清熱利濕、散瘀消腫之功效,用于急慢性肝炎,尤其對病毒性肝炎有特殊療效。綿茵陳是方中君藥。綠原酸是綿茵陳的主要活性成分之一,具有利膽、抗菌、清除自由基、抗氧化等多種藥理作用[2]。綠原酸抗氧化機理為其分子的酚羥基與有害自由基反應變成較穩定的半醌式自由基,從而終止有害自由基的鏈式反應。同時,綠原酸也能通過自身的還原性質直接給電子消耗掉有害自由基[3]。由于影響中成藥制劑有效成分含量的因素較多,例如不同產地,不同采集時間得到的中藥材其活性成分相差較大,制備工藝中溫濕度、液體用量、提取時間等對制劑質量均有一定的影響,因此,檢測制劑中有效成分的含量以保證療效是十分必要和可行的。

[1] 李忠.高效液相色譜法測定病毒清顆粒中綠原酸的含量.中國藥師 ,2005,5(8)：393-394.

[2] 任榮,李正翔,李彬,等.HPLC法測定涼血化斑顆粒劑中綠原酸的含量.中國醫院用藥評價和分析,2007,7(6)：441-443.

[3] 童珊珊,徐亞萍,金花,等.綿茵陳提取液中綠原酸的測定及其抗氧化活性研究.江蘇中醫藥,2009,41(4)：57-59.

545005廣西醫科大學第四附屬醫院