HSV-TK逆轉錄病毒包裝細胞系建立及病毒滴度測定

李 洋 錢 明 井宏宇 錢東華 (吉林大學第一醫院呼吸內科，吉林 長春 3002)

HSV-TK逆轉錄病毒包裝細胞系建立及病毒滴度測定

李 洋 錢 明1井宏宇 錢東華 (吉林大學第一醫院呼吸內科，吉林 長春 130021)

目的 建立HSV-TK逆轉錄病毒包裝細胞系并獲得高產病毒的細胞株。方法 將TK基因與逆轉錄表達載體PLEGFP-N1連接后轉染到包裝細胞PA317中，經G418及熒光蛋白雙重篩選得到高產病毒的細胞株。結果 經酶切鑒定成功構建PlEGFP-N1-TK重組載體，含HSV-TK基因重組逆轉錄病毒包裝細胞PA317成功建立，經病毒滴度測定獲得高產病毒的PA317/TK細胞株。結論 制備的重組病毒具有感染靶細胞的活性，為進一步應用HSV-TK基因進行肺癌的自殺基因治療研究奠定基礎。

HSV-TK;逆轉錄病毒;包裝細胞PA317

惡性腫瘤的基因治療是現代醫學領域的研究熱點，其中自殺基因療法已經成為極富希望的腫瘤治療新方法。自殺基因有多種，其中研究較多的主要有單純皰疹病毒胸苷激酶基因/丙氧鳥苷(HSV-TK/GCV)和大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶基因/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)兩種自殺基因系統。本實驗應用HSV-TK/GCV系統將TK基因與逆轉錄表達載體PLEGFP-N1連接后轉染到包裝細胞PA317中，經篩選得到高產病毒的細胞株，為HSV-TK/GCV自殺基因系統治療肺癌奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體、菌種和細胞株 pGEM-5Zf-HSV-TK，日本東京大學醫學部蘇肅博士慧贈;PLEGFP-N1，吉林大學第一醫院中心研究室保存;PA317細胞，購自Clontech公司;小鼠成纖維細胞(NIH3T3)細胞，購自中國科學院細胞庫;大腸桿菌DH5α，由東北師范大學遺傳病研究所實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 脂質體轉染試劑盒，凱基生物公司;高純度質粒提取試劑盒，TIANGE公司;DNA片段凝膠回收試劑盒、T4 DNA連接酶、限制性內切酶、DNA-Marker，TaKaRa公司;DNA測序，上海生工生物技術有限公司。

1.1.3 主要試劑的配制 LB液體培養基：胰蛋白胨10 g/L、酵母抽提物5 g/L、NaCl 10 g/L、pH7.0;LA液體培養基：在LB培養基中加入氨芐青霉素80 μg/ml。LB平板：LB培養基中按15 g/L濃度加入瓊脂粉;LA平板：LA培養基中按15 g/L濃度加入瓊脂粉;以上均需高壓滅菌(15磅、20 min)。溶液Ⅰ：25 mmol/L Tris-Cl(pH 8.0)，10 mmol/L EDTA.2Na(pH 8.0)，高壓滅菌30 min，4℃冰箱中備用;溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH，10%十二烷基硫酸鈉(SDS)，室溫保存，現用現配(0.2 mol/L，1%為終濃度);溶液Ⅲ：5 mol/L乙酸鉀 300 ml，冰醋酸57.5 ml，無菌水142.5 ml，室溫下混勻，4℃冰箱中備用。

1.1.4 主要儀器 CO2培養箱，SANYO日本;高速低溫離心機、PCR儀，美國Bio-Rad公司;DYY-Ⅲ穩亞穩流電泳儀、電泳槽，美國Bio-Rad公司;凝膠成像系統，美國IBM公司;ZF型紫外透射反射分析儀、GNP型隔水式恒溫培養箱，上海精宏實驗技術有限公司;快速恒溫數顯水箱，常州國華電器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 真核表達載體pLEGFP-N1-TK的構建與鑒定 將載體pGEM-5Zf-HSV-TK、PLEGFP-N1 1 μl加入一管已制備好的感受態細胞中〔1，2〕進行細菌轉化;含有 pGEM-5Zf-HSV-TK、PLEGFPN1轉化細菌大量培養及質粒的提取與純化;質粒的提取與純化，按照試劑盒說明操作。對pLEGFP-N1和pGEM-5Zf-HSVTK質粒DNA用BglⅡ和HindⅢ分別進行雙酶切，酶切后的plEGFP質粒和目的DNA片段TK按1∶5摩爾比進行連接，反應體系10 μl：T4 DNA 連接酶1 μl，16 ℃ 過夜反應。將連接產物進行轉化和篩選，之后進行重組載體的提取和鑒定，得到pLEGFP-N1-TK并進行重組質粒DNA的大量提取與純化。

1.2.2 PLEGFP-N1-TK重組質粒的轉染、克隆細胞株的轉移和擴增 用Lipofectamine2000將PLEGFP-N1-TK重組質粒轉染PA317細胞中，G418和倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白雙重篩選;將篩選出的克隆細胞株轉移并擴增，轉移的細胞克隆生長相互融合達80%時，用胰酶消化后，將其轉移入25 ml培養瓶中繼續培養，維持G418濃度在300 μg/ml。待細胞生長良好后，挑取生長良好的細胞株進行傳代擴增，用于病毒滴度測定。提取PA317和PA317/TK細胞DNA，用PCR檢測HSVTK基因整合情況。

1.2.3 重組逆轉錄病毒滴度的測定 取對數生長期的NIH3T3細胞，加含10%的小牛血清高清DMEM培養液，調整細胞濃度為2×105/ml，按1 ml/孔加入24孔板中，37℃ 5%CO2培養至細胞達60%融合。將收集到的含HSV-TK基因PA317 克隆細胞的病毒上清液分別作 10-1，10-2，10-3，10-4倍稀釋;倒去NIH3T3細胞培養孔內液體，分別吸取1.5 ml稀釋的病毒液(含polybrene 8 μg/ml)加入培養孔內，不同稀釋度病毒各加 2孔，置 37℃，5%CO2條件下培養 3 d;更換含800 μg/ml G418的培養液，繼續培養7～10 d，其間每3～4 d換液一次。未感染病毒的NIH3T3細胞在加入等量的G418后，一般第3～5天開始死亡，第7～10天基本完全死亡;而感染病毒的NIH3T3細胞仍有細胞存活，并逐漸會有新的細胞開始生長。約2 w細胞克隆基本完成;統計細胞克隆數，計算病毒滴度。

病毒滴度(CFU/ml)=2瓶細胞克隆數的平均數×病毒稀釋液倍數(其中CFU為colony forming units)。

2 結果

2.1 重組載體pLEGFP-TK構建 將pLEGFP-N1質粒和pGEM-5Zf-HSV-TK分別以HindⅢ和BglⅡ進行酶切，經回收純化和連接反應，構建成功PlEGFP-N1-TK重組載體，行凝膠電泳。見圖1，圖2。

2.2 重組載體pLEGFP-N1-TK的酶切鑒定結果 重組質粒分別進行HindⅢ和BglⅡ雙酶切，將酶切產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下觀察，結果在預期位置出現陽性條帶與實驗預想一致。見圖3。

2.3 含HSV-TK基因重組逆轉錄病毒包裝細胞PA317的建立

用脂質體轉染法將載體pLEGFP-N1-TK導入PA317細胞，用400 μg/ml的G418篩選2 d后，細胞開始死亡;在4～5 d內死亡達高峰;5 d后有少數細胞貼壁生長;1 w后細胞逐漸形成陽性克隆細胞團;培養14 d后，篩選得到陽性克隆細胞。挑取其中生長較好的抗G418及帶有綠色熒光的細胞克隆，再用含G418 800 μg/ml的低糖DMEM培養液進一步選擇培養，最后形成的陽性克隆細胞命名為PA317/TK。見圖4，圖5。

2.4 PCR檢測HSV-TK基因在PA317中整合情況 經PCR鑒定在PA317/TK細胞中檢測到完整的約1.1 kb TK基因，而未轉染TK基因的PA317細胞沒有檢測到TK基因。

2.5 PA317/TK細胞產病毒的滴度測定 用最終濃度800 μg/ml的G418篩選到的PA317/TK擴大培養后，收集病毒液，感染NIH3T3測定病毒滴度，結果為4×104cfu/ml。

圖1 pLEGFP質粒雙酶切圖

圖2 pGEM-5Zf-HSV-TK雙酶切

圖3 重組載體pLEGFP-N1-TK雙酶切結果

圖4 PA317/TK細胞在熒光纖維鏡下表現(×400)

圖5 經篩選形成陽性克隆細胞團(×400)

3 討論

在目前的眾多基因治療實驗中，逆轉錄病毒載體是被廣泛采用的載體之一〔3〕，經過人工構建去除其中的3個功能基因(pol，gag，env)，保留了其中的長末端重復序列(LTR)和包裝序列ψ的復制缺陷型病毒，因此它不具備感染細胞的能力。它必需與一種經過改造的含有輔助病毒基因組的包裝細胞相互重組，將病毒RNA包裝進去，才產生具有感染能力的完整病毒顆粒，此病毒顆粒能感染靶細胞，但不能復制〔4〕。PA317是逆轉錄病毒的包裝細胞，其內有逆轉錄病毒的輔助病毒基因組。因此，本文通過把帶有TK基因的逆轉錄病毒載體PLEGFP-N1導入PA317中，建立含HSV-TK重組逆轉錄病毒包裝細胞。

逆轉錄病毒載體PLEGFP-N1包含一個選擇標記新霉素磷酸轉移酶基因(neo)，此外還有一個加強綠色熒光蛋白基因(green fluorescent protein，GFP)。當PLEGFP-N1-TK導入PA317后通過G418及GFP篩選得到細胞陽性克隆，在抗生素G418存在的培養基中，沒有被導入PLEGFP-N1-TK的PA317細胞逐漸死亡，而導入PLEGFP-N1-TK的PA317細胞存活并逐漸生長，從而得到陽性細胞克隆PA317/TK。在G418篩選之前應做預實驗，找出G418最適宜濃度，在最初篩選時應注意G418的濃度不能過高，待細胞生長穩定，neo基因在細胞中的表達達到一定程度時再改換高濃度的G418，以維持細胞克隆的篩選。本實驗G418的初始篩選濃度為400 μg/ml，維持細胞克隆篩選濃度為800 μg/ml。由于逆轉錄病毒載體PLEGFP-N1含有GFP，所以通過倒置的熒光纖維鏡觀看被轉染的PA317發出綠色熒光來進一步篩選陽性細胞克隆〔5〕。再通過病毒滴定度的測定挑選出產病毒較高的細胞株。

本實驗將HSV-TK基因克隆至逆轉錄病毒表達載體PLEGFP-N1，經測TK基因序列正確后，用脂質體法將重組質粒導入逆轉錄病毒包裝細胞PA317，包裝后篩選出一株產感染性重組病毒細胞系PA317/TK，收集PA317/TK細胞培養上清液，再感染NI3T3細胞，測得病毒滴定度為4×104cfu/ml，從而證實了本實驗制備的重組病毒具有感染靶細胞的活性，為進一步應用HSV-TK基因進行肺癌的自殺基因治療研究奠定基礎。

1 Culver KW，Ram Z，Wallbridge S，et al.In vivo gene transfer with retroviral vector-producer cells for treatment of experimental brain tumors〔J〕.Science，1992;256(5063)：1550-2.

2 Vitek JA.Reliability of the“kiss of death”method for evaluation of intercellular communication：effect of cloning and culture technique〔J〕.Folia Biol(Praha)，1989;35(3)：171-6.

3 Jolly D.Viral vector systems for gene therapy〔J〕.Cancer Gene Ther，1994;1(1)：51-64.

4 Reeves L，Smucker P，Cornetta K.Packaging cell line characteristics and optimizing retroviral vector titer：the National Gene Vector Laboratory Experience〔J〕.Hum Gene Ther，2000;11(15)：2093-103.

5 Chalfie M，Tu Y，Euskirchen G，et al.Green fluorescent protein as a marker for gene expression〔J〕.Science，1994;263(5148)：802-5.

Q344+.13

A

1005-9202(2011)16-3101-03

吉林省衛生廳資助項目(No.1021Z031);吉林大學研究生創新基金(No.醫學704053)

1 吉林大學口腔醫院

錢東華(1965-)，女，副教授，碩士生導師，主要從事肺癌及肺部感染性疾病研究。

李 洋(1979-)，女，主治醫師，博士，主要從事肺癌和哮喘的研究。

〔2011-01-29收稿 2011-03-25修回〕

(編輯 袁左鳴/徐 杰)