轉錄抑制因子ZHX2功能片段原核表達載體的構建及表達

趙紅蕾 曹 宏 孫月芳 田曉豐 (吉林大學畜牧獸醫學院，吉林 長春 30062)

轉錄抑制因子ZHX2功能片段原核表達載體的構建及表達

趙紅蕾 曹 宏1孫月芳1田曉豐1(吉林大學畜牧獸醫學院，吉林 長春 130062)

目的 從人正常組織中克隆人轉錄抑制因子ZHX2功能片段，構建其原核表達載體，并在大腸桿菌中進行表達，純化獲得蛋白，用于下一步探討ZHX2基因的功能。方法 根據GenBank中ZHX2功能片段已知序列設計引物，從正常人組織中通過RT-PCR方法擴增ZHX2基因功能片段，克隆到原核表達載體pET28a(+)中，轉化Ecoli.BL21(DE3)，IPTG誘導表達，采用鎳柱親和層析法純化目的蛋白。結果 測序結果顯示克隆的ZHX2基因序列正確，SDS-PAGE鑒定表達產物分子量正確，Western-blot鑒定結果顯示表達產物為人ZHX2功能片段特異性蛋白。結論 本研究成功構建了含有ZHX2功能片段的原核融合表達載體，并實現了ZHX2功能片段的表達，獲得了純化的蛋白，為進一步研究ZHX2基因的功能奠定了基礎。

ZHX2基因;轉錄抑制因子;原核表達

ZHX(zinc-fingers and homeoboxes，ZHX)蛋白家族包括ZHX1、ZHX2和ZHX3，在人體組織中廣泛存在，在組織中作為轉錄抑制因子發揮重要的病理生理功能〔1，2〕。ZHX2是ZHX蛋白家族成員之一，是2003年新克隆的轉錄抑制因子，位于染色體8q24.13，其編碼的蛋白含837個氨基酸殘基，定位于細胞核內〔3〕。近年來的研究結果顯示，ZHX2參與正常肝細胞中肝癌標志物的轉錄抑制，提示ZHX2的表達缺失可能是肝細胞癌發生的關鍵因素〔4〕。本研究設計構建人ZHX2基因功能片段的原核表達載體，為進一步確定ZHX2蛋白發揮有效生物學作用的最小功能片段奠定基礎，同時也為進一步研究ZHX2基因的功能提供實驗材料。

1 材料與方法

1.1 菌株和質粒 大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)pLysS由本室保存，pMD-18T載體購自Takara公司，原核表達載體pET28a(+)由本室保存。

1.2 試劑 總RNA提取試劑盒Trizol reagent和逆轉錄試劑盒Thermoscript TM RT-PCR SYSTEM為GIBCo BRL公司產品;T4 DNA ligase為Promega公司產品;DL 2000 DNA Marker、質粒小量抽提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、X-gal、IPTG均購自TaKaRa公司;低分子量蛋白 Marker(97.4、66.2、43.0、31.0、20.1、14.4 kU)購自上海生物化學研究所，窄譜預染蛋白質Marker(71、50、35、25、16、8 和 2 kU)購自賽百盛基因技術有限公司;ZHX2單克隆抗體購自 Santa Cruz Biotechnology公司;HRP兔抗小鼠IgG購自北京中山金橋生物技術有限公司;其他試劑均為國產或進口分析純。

1.3 引物設計 根據GenBank中人ZHX2 cDNA序列(gi：63079684)使用Prim 5軟件在ZHX2基因的上下游設計F1和R1兩條引物，上游引物F1：5'GAA TTC GTG ACA GAC ACA GCT GAG ATC C 3';下游引物 R1：5'CTC GAG GCC CCT TTG ACA CCG ATA T 3'，分別含EcoR I和Sal I酶切位點，理論擴增目的片段為837 bp，引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.4 人ZHX2基因功能片段的克隆及測序 用Trizol reagent提取人正常肝組織總RNA，具體操作按文獻〔5〕方法進行，沉淀置于室溫干燥后加入30 μl水(含RNase inhibitor l μl)溶解，取3～5 μl進行瓊脂糖凝膠電泳檢查。立即進行逆轉錄或加入2倍體積的乙醇-80℃保存備用。逆轉錄和PCR反應嚴格按照試劑盒操作說明進行。取RNA 1 μg參照Quant script RT Kit試劑盒說明操作，取Quant Reverse Transcrplase 1 μl以及10×RT mix、dNTP 混合液(2.5 mmol/L)、Random(10 μmol/L) 各2 μl，加 DEPC 水定容至20 μl，37℃孵育60 min。所得 cDNA 用DEPC水稀釋至50 μl置于-20℃保存備用。PCR擴增按50 μl體系進行，取2 μl逆轉錄產物為模板，以引物F1/R1對RT產物進行擴增，94℃，2 min預變性;循環參數為：94℃ 30 s，58℃30 s，72℃ 80 s，35個循環;然后72℃延伸7 min。擴增結束后，對PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，切膠。用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段，并與pMD-18T載體連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態，PCR及酶切鑒定陽性克隆，初步鑒定成功的pMD-18T-ZHX2質粒送大連寶生物公司測序。

1.5 人ZHX2基因功能片段原核表達載體的構建 以EcoR I和Sal I對pMD-18T-ZHX2質粒和pET28a(+)載體雙酶切，回收后連接、轉換大腸桿菌BL21(DE3)pLysS感受態細胞，篩選陽性克隆進行PCR和酶切鑒定。鑒定正確質粒命名為pET28a-ZHX2。

1.6 目的蛋白的誘導表達、純化及鑒定 將含有表達載體pET28a-ZHX2的宿主菌接種含卡那霉素(30 μg/ml)的LB液體培養基，37℃搖震培養至 OD600 0.4～0.6，加入終濃度1 mmol/L的IPTG誘導3～5 h，離心收集菌體，加入原培養液1/10體積的0.1 mol/L PBS重懸菌體，-20℃保存備用。培養液在4℃、5 500 r/min離心20 min，收集細胞沉淀物，沉淀物經超聲裂解后用相同體積的PBS(pH7.0)重懸，沉淀和上清通過12 000 r/min離心20 min進行分離。進行SDS-PAGE檢測分析，產物經Ni-NTA樹脂純化。把可溶上清液轉移到純化柱上，然后用5倍體積的PBS(pH7.0)溶液沖洗純化柱。目的蛋白分別用含有10、20、50、100 mmol/L咪唑的 PBS(pH7.0)進行梯度洗脫。洗脫液經透析、濃縮、過濾除菌，Bradford法測定蛋白濃度后-70℃保存。

SDS-PAGE按文獻〔5〕方法進行：灌制12%聚丙烯酰胺分離膠和5%的濃縮膠，取收集的上清20 μl和少量上樣緩沖液混勻后上樣，0.25%考馬斯亮藍R-250染色，凝膠成像系統掃描分析表達產物。Western印跡檢測按文獻〔6〕所述方法進行，轉膜后在含有5%脫脂牛奶封閉液中封閉1 h，之后膜在1∶1 000的ZHX2單克隆抗體中4℃雜交過夜，第二天用PBS洗3次之后用1∶2 000的HRP標記的兔抗小鼠IgG二抗雜交1 h，PBS洗3次，在ECL儀器上用ECL底物發光液顯影。

2 結果

2.1 ZHX2的克隆測序結果 ZHX2基因功能片段RT-PCR擴增后得到特異性的目的片段，結果如圖1所示，用引物F1/R1進行PCR，得到大小為837 bp的片段，擴增結果與預期相符。經測序，與GenBank序列信息一致。

2.2 ZHX2原核表達載體的構建和鑒定結果 菌落PCR結果表明，插入片段與目的片段大小一致。pET28a-ZHX2重組質粒用EcoR I和Sal I雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳，結果表明酶切后的片段大小約3 000 bp和837 bp，說明外源片段已插入。見圖1。

2.3 ZHX2蛋白的誘導表達和鑒定結果 pET28a(+)-ZHX2重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)pLysS進行目的蛋白的誘導表達，在30℃，0.4 mmol/L IPTG誘導4 h，誘導的表達產物經純化后，取上清液進行SDS-PAGE電泳，結果顯示有融合蛋白表達，分子質量約為31 kD，與預期相符合。Western印跡結果顯示，純化后的表達蛋白與商品化的ZHX2單克隆抗體在32 kD處出現特異性條帶。見圖1。

圖1 ZHX2克隆、pET28a-ZHX2重組質粒及ZHX2蛋白誘導表達和蛋白結果

3 討論

ZHX 蛋白家族分子結構中均包括兩個鋅指結構(zinc-finger motifs)和五個同源結構域(homeo domains，HDs)。三種蛋白自身可組成同源二聚體，兩種蛋白相互之間也可形成異源二聚體，ZHX2在肝、腎、脾臟等不同組織中都有很廣泛的表達〔7〕，近期研究顯示ZHX2可能參與多種疾病的發生發展：ZHX2不僅抑制肝癌細胞AFP的表達，而且在腎病綜合征中參與腎小球內足細胞的調控〔8〕;另有研究顯示，ZHX2表達與多發性骨髓瘤惡性程度及患者愈后呈負相關〔9〕。上述研究提示ZHX2可能是一個重要的抑癌基因。

ZHX2和ZHX1具有較高的同源性，在編碼序列和氨基酸序列上的同源性分別為45.5%和41.9%。ZHX2主要定位在核內，有兩個核定位信號，位于第317位氨基酸和第446位氨基酸之間。ZHX2蛋白間可形成同源二聚體，也可以與同家族成員ZHX1或ZHX3形成異源二聚體，二聚體結合區位于HDI(第195位氨基酸和第358位氨基酸之間)。ZHX家族成員結構相似，分子量大小相近。因此，抗原設計時應盡量避開共同或相似結構域。Yamada〔4〕報道，ZHX2蛋白263AA～497AA之間有一個脯氨酸富集區，是不同于ZHX1和ZHX3的一個特殊結構域，通過BLAST對比分析ZHX家族氨基酸序列發現，ZHX2在263AA～497AA區域內較其他成員同源性低。王金金等〔10〕對人的ZHX2基因進行了真核表達，通過對表達結果的對比分析，將ZHX2的最小抑制區域縮小到242AA～501AA區域內。本研究根據上述研究結果，針對其設計的抗原片段更易產出特異性強的抗體，原核細胞中表達蛋白純化后免疫動物獲得血清，Western印跡結果顯示制備的抗體具有良好的特異性。

ZHX2蛋白全長837個氨基酸，含有多個功能域，但并非所有功能域都具有抑制功能。Kawata等〔3〕構建了ZHX2系列缺失表達載體，經共轉染實驗和報告基因分析結果發現，ZHX2抑制cdc25基因啟動子的最小抑制區域在氨基酸序列263～446范圍內，這個區域包含了整個HD1區和脯氨酸富含區，但該功能域是否同樣是ZHX2抑制AFP、參與HCC及多種疾病發生的最小功能域，迄今尚不清楚。本研究根據ZHX2的編碼序列，成功構建了人ZHX2基因功能片段的原核表達載體pET28a-ZHX2，并轉化大腸桿菌BL21(DE3)，在IPTG誘導下實現了目的蛋白的可溶性表達，Western印跡結果表明，本實驗獲得的表達蛋白為ZHX2基因特異性蛋白，為基因工程生產和改造ZHX2創造了條件，也為進一步闡明ZHX2基因的結構與功能及其在疾病發生中的作用奠定了基礎。

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2 Shen H，Luan F，Liu H，et al.ZHX2 is a repressor of Alpha to protein expression in human hepatoma cell lines〔J〕.J Cell Mol Med，2008;12(6B)：2772-80.

3 Kawata H，Yamada K，Shou ZF，et al.Zinc-fingers and homeoboxes(ZHX)2，a novel member of the ZHX family functions as a transcriptional repressor〔J〕.Biochem J，2003;373(Pt3)：747-57.

4 Yamada K，Ogata-Kawata H，Matsuura K，et al.ZHX2 and ZHX3 repress cancer markers in normal hepatocytes〔J〕.Front Biosci，2009;14(1)：3724-32.

5 薩姆布魯克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T，著.金冬雁，黎孟楓，侯云德，譯.分子克隆實驗指南〔M〕.北京：科學出版社，2002：362-92.

6 潘 穎，毛麗君，孫艷霞，等.RhoC-miRNA真核表達載體的構建及其在卵巢癌細胞系中穩定表達〔J〕.中國老年學雜志，2009;29(3)：277-9.

7 Perincheri S，Dingle RW，Peterson ML，et al.Hereditary persistence of alpha-protein and H19 expression in liver of BALB/cJ mice is due to a retrovirus insertion in the ZHX2 gene〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2005;102(2)：396-401.

8 Liu C，Clement LC，Kanwar YS，et al.ZHX proteins regulate podocyte gene expression during the development of nephritic syndrome〔J〕.Biol Chem，2007;281(51)：39681-92.

9 Armelliui A，Sarasquete ME，Curca-Suuz R，et al.Low expression of ZHX2，but not RCBTB2 or RAN，is associated with poor outcome in multiple myeloma〔J〕.Br J Haematol，2008;141(2)：212-5.

10 王金金，史 偉，祁建妮，等.轉錄抑制因子ZHX2功能片段的克隆及表達〔J〕.山東大學學報(醫學版)，2009;47(5)：1-4.

R996

A

1005-9202(2011)16-3115-03

1 吉林大學第二醫院普外科中心

田曉豐(1976-)，男，博士后，主治醫師，主要從事肝膽胰外科臨床及基礎研究。

趙紅蕾(1987-)，女，碩士，主要從事分子免疫學研究。

〔2011-02-15收稿 2011-05-07修回〕

(編輯 徐 杰)