IRX1在胰腺癌中的表達及其啟動子區甲基化狀態

衛巍 徐凌 王鋒 何珊珊 楊麗娟 郭傳勇 王興鵬

·論著·

IRX1在胰腺癌中的表達及其啟動子區甲基化狀態

衛巍 徐凌 王鋒 何珊珊 楊麗娟 郭傳勇 王興鵬

目的檢測胰腺癌的易洛魁族同源盒基因(IRX1)的表達及其啟動子區的甲基化狀態，探討兩者間的相關性。方法采用實時PCR法檢測12例胰腺癌組織及6株胰腺癌細胞株的IRX1 mRNA表達?；蛐蛄蟹治鯥RX1基因啟動子區結構。應用甲基化抑制劑5- 氮雜-2′-脫氧胞苷(5-Aza-dC)處理胰腺癌細胞，采用甲基化特異性PCR(MSP)、非甲基化特異性PCR(USP)及實時PCR檢測處理前后IRX1啟動子甲基化狀態和IRX1 mRNA表達。結果胰腺癌組織IRX1 mRNA的表達量為0.31±0.11，顯著低于癌旁正常胰腺組織的1.05±0.32(P<0.01)。胰腺癌細胞AsPC1、BxPC3、Capan-2、PANC1、PaTu8988和SW1990的IRX1 mRNA表達量分別為0.36±0.08、0.34±0.16、0.37±0.11、0.25±0.06、0.31±0.04、0.36±0.02，均顯著低于人腎上皮293細胞的1.03±0.28(P<0.05或<0.01)。IRX1基因啟動子區富含CpG島。各胰腺癌細胞株IRX1基因啟動子CpG島對應位點均有甲基化，經5-Aza-dC處理后甲基化狀態得以逆轉，IRX mRNA的表達也得以恢復。結論胰腺癌的IRX1mRNA表達下降，與其IRX1基因啟動子區CpG島高甲基化狀態相關。

胰腺腫瘤； 啟動子； 甲基化； IRX1

易洛魁族同源盒(iroquois homeobox, IRX)基因最早在果蠅的神經系統發育研究中被發現，編碼一個含高度保守同源盒序列的三氨基酸環延伸(three amino acid extension, TALE)超家族蛋白[1-2]。人類IRX家族成員共有6種，根據染色體的定位分為兩簇，其中IRX1基因位于5號染色體短臂5p15.33區，該區域在多種腫瘤中均存在不穩定性[3-5]。 IRX1在頭頸項腫瘤和胃癌的研究中常表達降低[6]，并與腫瘤的形態學和臨床表型存在一定相關性。本研究測定胰腺癌、癌旁組織及各胰腺癌細胞株中該基因的表達水平，分析IRX1基因調控區的甲基化狀態，為闡明其在胰腺癌發生及進展過程中的分子作用機制提供一定的實驗依據。

材料與方法

一、材料

人胰腺癌細胞株AsPC1、BxPC3、Capan-2、PANC1、PaTu8988和SW1990為本實驗室保存，常規培養，傳代。待細胞生長到指數階段時用終濃度為0.5 μmol/L的5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-Aza-dC)處理5 d，以未干預的細胞作為對照組，收集各組對數生長期細胞。12例胰腺癌及癌旁正常組織為上海第十人民醫院保存的經病理證實的2006年至2009年間手術切除標本。應用Trizol試劑(上海英駿生物技術公司)抽提細胞及組織總RNA；應用酚氯仿法常規抽提各細胞株基因組DNA。

二、方法

1．實時PCR法測定IRX1 mRNA表達：應用Primer Express 3.0軟件設計引物。IRX1引物序列上游 5′-AGTTAAAGTCGCCCTTCCAG-3′，下游5′-CCC-CGCAAAAGTAAAAGAAGAC-3′，擴增片段120 bp；內參β-actin引物序列上游 5′-CTGGAACGGTGA-AGGTGACA-3′，下游5′-AAGGGACTTCCTGTAACA-ATGCA-3′，擴增片段140 bp。引物序列由上海生工生物工程公司合成。運用ABI7900HT PCR儀進行實時PCR，反應條件：95 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，60℃ 1 min，35個循環，所得數據經2-ΔΔCt處理后進行分析[7]。

2．IRX1基因結構分析：利用NCBI數據庫的Splign分析IRX1基因的序列；Ensemble數據庫分析IRX1轉錄本的5′-upstream序列，尋找啟動區的典型結構；MethPrimer軟件分析啟動子區CpG島的狀況。

3．IRX1基因調控區CpG島甲基化狀態分析：采用甲基化特異性PCR(methylation-specific PCR, MSP)和非甲基化特異性PCR(unmethylation-specific PCR,USP)法檢測。取500 ng純化DNA進行亞硫酸氫鹽修飾。MethPrimer軟件設計IRX1啟動子CpG島MSP及USP引物。MSP上游5′-GTTGTT-ATTAGCGTTTAGGTCGTC-3′，下游5′-ATCTAACAC-CGAATTTACAATTTCG-3′，擴增片段127 bp；USP上游5′-TTGTTATTAGTGTTTAGGTTGTTGG-3′，下游5′-CTATCTAACACCAAATTTACAATTTCAC-3′，擴增片段128 bp。選用Hotstar Taq酶進行反應，反應條件：95℃ 3 min，94℃ 30 s，60℃ 1 min，35個循環。

三、統計學處理

結 果

一、胰腺癌組織及細胞株的IRX1 mRNA表達

胰腺癌組織IRX1 mRNA的表達量為0.31±0.11，顯著低于癌旁正常胰腺組織的1.05±0.32(P<0.01)。胰腺癌細胞AsPC1、BxPC3、Capan-2、PANC1、PaTu8988和SW1990的IRX1 mRNA表達量分別為0.36±0.08、0.34±0.16、0.37±0.11、0.25±0.06、0.31±0.04、0.36±0.02，均顯著低于對照組的人腎上皮293細胞的1.03±0.28(P<0.05或<0.01)，其中PANC1細胞的表達最低。

二、IRX1基因結構

IRX1基因由4個不同大小的外顯子構成，僅存在一種轉錄本模式，其轉錄起始點(transcription start site，TSS)上游的啟動子區GC含量高達60%以上，存在多個CpG位點，長度超過600 bp(圖1)。

圖1 IRX1基因序列分析圖

三、各胰腺癌細胞株IRX1基因調控區CpG島甲基化狀態

各胰腺癌細胞株IRX1基因啟動子CpG島對應位點均有甲基化，其中PANC1和PaTu8988兩株細胞USP條帶幾乎不可見(圖2)。

M: MSP；U: USP；1: AsPC1; 2: BxPC3；3: Capan-2; 4: PANC1; 5: SW1990; 6: PaTu8988

圖2胰腺癌細胞株IRX1基因調控區的甲基化狀態

四、5-Aza-dC處理后各胰腺癌細胞株IRX1基因調控區CpG島甲基化狀態及IRX1 mRNA表達的變化

經5-Aza-dC處理后，各胰腺癌細胞株的IRX1基因啟動子區CpG島甲基化程度均有大幅降低(圖3)；AsPC1、BxPC3、Capan-2、PANC1、PaTu8988和SW1990細胞IRX1 mRNA表達量分別為3.04±0.53、2.24±0.39、2.26±0.28、2.43±0.26、2.64±0.97、1.79±0.05，均較未處理組的1.02±0.22、1.02±0.21、1.04±0.33、1.06±0.46、1.00±0.08、1.02±0.23顯著上調(P<0.05或<0.01)。

M: MSP; U: USP; 1: AsPC1; 2: BxPC3; 3: Capan-2; 4: PANC1; 5: SW1990; 6: PaTu8988

圖35-Aza-dC處理后胰腺癌細胞株IRX1基因啟動子區CpG島甲基化狀態

討 論

胰腺癌作為病死率最高的人類腫瘤之一，其發生進展是一個涉及多種基因的多階段、多步驟的復雜的生物學過程[8]。DNA甲基化是其中一種精確的調控方式，是真核細胞正常而普遍的修飾方式，是哺乳動物表達調控的主要表遺傳學形式，是將基因型與表型聯系起來的一條紐帶[9-10]。研究表明，遺傳表型改變，特別是抑癌基因啟動子區域內CpG島出現異常甲基化而失活參與了部分胰腺癌的發生過程[11]。目前認為啟動子區CpG島高甲基化可能引起轉錄抑制，因此DNA啟動子區域的甲基化被看作是腫瘤抑制基因失活的主要機制[12]。

本實驗結果顯示，胰腺癌組織及各胰腺癌細胞

株中IRX1 mRNA表達水平均較正常胰腺組織顯著降低。通過對IRX1基因序列分析，發現該基因啟動子區GC含量較高，并存在一個長度超過600 bp的CpG島，我們推測IRX1基因CpG島的高甲基化可能是導致其表達下調的主要原因。為此，本研究檢測各胰腺癌細胞株中IRX1基因的甲基化狀態，結果顯示所有6株腫瘤細胞株IRX1基因啟動子CpG島對應位點均有不同程度的甲基化。應用5-Aza-dC處理后，IRX1基因的甲基化得到逆轉，IRX1 mRNA的表達得到很大程度的恢復，證實異常甲基化是胰腺癌中抑癌基因IRX1失活的機制之一。

[1] Dambly-Chaudière C,Leyns L.The determination of sense organs in Drosophila:a search for interacting genes.Int J Dev Biol,1992,36: 85-91.

[2] Bürglin TR. Analysis of TALE superclass homeobox genes (MEIS, PBC, KNOX, Iroquois, TGIF) reveals a novel domain conserved between plants and animals. Nucleic Acids Res,1997,25:4173-4180.

[3] Xu SF, Peng ZH, Li DP, et al. Refinement of heterozygosity loss on chromosome 5p15 in sporadic colorectal cancer. World J Gastroenterol,2003,9:1713-1718.

[4] B?hm M, Wieland I, Schmidt C, et al. Loss of heterozygosity on chromosome 5p13-12 predicts adverse prognosis in advanced bladder cancer independent of tumor stage and grade. J Urol,2002,168:2655-2658.

[5] Becker MB, Zülch A, Bosse A, et al. Irx1 and Irx2 expression in early lung development. Mech Dev,2001,106:155-158.

[6] Bennett KL, Karpenko M, Lin MT, et al. Frequently methylated tumor suppressor genes in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Res,2008,68: 4494-4499.

[7] Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-△△Ctmethod. Methods,2001,25:402-408.

[8] Grover S,Syngal S.Hereditary pancreatic cancer.Gastroenterology,2010,139:1076-1080.

[9] De Carvalho DD, You JS, Jones PA. DNA methylation and cellular reprogramming. Trends Cell Biol,2010,20: 609-617.

[10] Maunakea AK, Chepelev I, Zhao K, et al. Epigenome mapping in normal and disease states. Circ Res,2010,107: 327-339.

[11] Attri J, Srinivasan R, Majumdar S, et al. Alterations of tumor suppressor gene p16 INK4a in pancreatic ductal carcinoma. BMC Gastroenterol,2005,5:22.

[12] Meléndez B,Malumbres M,Pérez de Castro I,et al.Characterization of the murine p 19 (ARF) promoter CpG island and its methylation pattem in primary lymphomas.Carcinogenesis,2000,21:817-821.

2010-11-04)

(本文編輯：呂芳萍)

ExpressionandmethylationofIroquoishomeoboxprotein1inpancreaticcancer

WEIWei,XULing,WANGFeng,HEShan-shan,YANGLi-juan,GUOChuan-yong,WANGXing-peng.

DepartmentofGastroenterology,ShanghaiTenthPeople′sHospital,TongjiUniversity,Shanghai200072,China

WANGXing-peng,Email：wangxingpeng@hotmail.com

ObjectiveTo investigate the expression of Iroquois homeobox protein 1 (IRX1) gene and the hypermethylation status of its promoter in pancreatic cancer, and their relationship.MethodsReal-time PCR was used to quantitatively detect IRX1 gene expression level of 12 sets of resected pancreatic cancer tissue and 6 sets of pancreatic cancer cell lines; gene sequences analysis was used to detect the structure of IRX1 promoter; DNA methylation inhibitor 5-Aza-2′-deoxycytidine (5-Aza-dC) was used in pancreatic cancer cell lines, and then the methylation of IRX 1 was measured by methylation-specific PCR (MSP) and unmethylation sequence-PCR (USP) methods.ResultsExpression of IRX1 mRNA in pancreatic cancer tissue was 0.31±0.11, which were significantly lower than that in normal pancreatic tissue (1.05±0.32,P<0.01). IRX1 mRNA expression of AsPC1, BxPC3, Capan 2, PANC1, PaTu8988 and SW1990 were 0.36±0.08, 0.34±0.16, 0.37±0.11,0.25±0.06, 0.31±0.04, 0.36±0.02, which were significantly lower than that in human kidney epithelial 293 cells (1.03±0.28,P<0.05 or <0.01). Analysis of IRX1 gene sequence showed abundant CpG islands in promoter. Hypermethylation of IRX1 promoter site was found in all pancreatic cancer cell lines. However, its methylation status could be reversed by 5-Aza-dC, and the IRX1 expression was also restored.ConclusionsIRX1 mRNA expression is down-regulated in pancreatic cancer, and it is related with promoter CpG islands hypermethylation.

Pancreatic neoplasms； Promoter； Methylation； IRX1

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.05.002

國家自然基金(81072065)；上海市科委基金(08411963000, 09410705400)

200072 上海，同濟大學附屬第十人民醫院肝膽胰內科

王興鵬，Email：wangxingpeng@hotmail.com