HDAC1基因沉默對人胰腺癌細胞PaTu8988細胞周期的影響

高道鍵 滿曉華 徐岷 張玉琦 高軍 龔燕芳 吳紅玉 金晶 許國銘 李兆申

·論著·

HDAC1基因沉默對人胰腺癌細胞PaTu8988細胞周期的影響

高道鍵 滿曉華 徐岷 張玉琦 高軍 龔燕芳 吳紅玉 金晶 許國銘 李兆申

目的探討組蛋白脫乙酰基酶1(HDAC1)基因沉默對人胰腺癌PaTu8988細胞周期影響及可能機制。方法常規培養胰腺癌PaTu8988細胞，分為對照組、陰性siRNA轉染 (c-siRNA)組及15、30 nmol/L HDAC1 siRNA轉染組。采用脂質體2000轉染細胞48 h后，應用蛋白質印跡法檢測細胞HDAC1基因沉默效率及p21基因表達；流式細胞法檢測細胞周期的變化。結果與對照組比較，30 nmol/L HDAC1 siRNA組PaTu8988細胞的HDAC1蛋白表達明顯下降，p21蛋白表達明顯增加；G2/M期細胞比例顯著減少[(21.48±3.67)%比(28.28±2.94)%，P<0.05]，S期細胞比例顯著增加[(50.20±6.85)%比(32.49±2.78)%,P<0.05]。結論HDAC1 siRNA能特異、有效地抑制人胰腺癌PaTu8988細胞HDAC1的表達，引起細胞S期阻滯，其機制可能與上調p21蛋白表達有關。

胰腺腫瘤； 組蛋白脫乙酰基酶類； RNA干擾； 細胞周期

共同第一作者：滿曉華

組蛋白乙酰化狀態由組蛋白乙酰基酶和組蛋白脫乙酰基酶(histone deacetylase,HDACs)調節，組蛋白乙酰化狀態的失衡與腫瘤的發生密切相關[1]。腫瘤細胞HDAC 1高表達可明顯增強腫瘤細胞的增殖能力，并通過影響細胞外基質而使腫瘤細胞移行和侵襲力明顯增強[2]。我們前期研究[3]結果顯示，HDAC1 siRNA轉染人胰腺癌PaTu8988細胞后能特異、有效地抑制細胞HDAC1表達，抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡。有研究發現，HDAC抑制劑可影響細胞周期，故本研究觀察HDAC1對胰腺癌細胞周期的調控作用及其機制。

材料和方法

一、細胞培養及分組

PaTu8988胰腺癌細胞系由德國Marburg市Philipps大學細胞生物學和分子病理學研究所Elsasser博士惠贈，常規培養傳代。取對數生長期細胞，按1×105/孔接種于培養板培養過夜，分為對照組、對照siRNA(c-siRNA)組，HDAC1 siRNA 15、30 nmol/L組。每組3個復孔。對照組未予任何處理； c-siRNA組和HDAC1 siRNA 15、30 nmol/L組分別采用脂質體2000(美國Invitrogen公司)將30 nmol/L的c-siRNA或15、30 nmol/L的HDAC1 siRNA轉染PaTu8988細胞。HDAC1 siRNA和c-siRNA由美國Ambion公司設計和合成，HDAC1 siRNA正義鏈：5′-GCCGGUCAUGUCCAAAGUATT-3′，反義鏈：5′-UACUUUGGACAUGACCGGCTT-3′。 轉染步驟參見美國Invitrogen公司的轉染操作手冊，轉染6 h后更換成DMEM培養液，常規培養48 h后消化，收集細胞。

二、HDAC1、p21蛋白檢測

提取各組細胞總蛋白，采用BCA 法行蛋白定量，取20 μg蛋白常規行蛋白質印跡法檢測HDAC1、p21蛋白表達。兔抗人HDAC1多抗(sc-7872，Santa Cruz公司)工作濃度1∶1000；鼠p21單抗(AP021,碧云天公司)工作濃度1∶500；HRP標記羊抗兔二抗工作濃度1∶2000。最后ECL發光,X片曝光，暗室顯影、定影后掃描。以GAPDH作為內參照。

三、細胞周期檢測

收集各組細胞，用預冷PBS洗后制成細胞懸液，加入預冷的70%乙醇4℃固定過夜。加入100 μg/ml的RNase 10 μl、50 μg/ml的碘化丙啶300 μl(晶美生物公司)，4℃避光孵育30 min，上流式細胞儀檢測。具體步驟按晶美生物公司的操作手冊。

四、統計學處理

結 果

一、PaTu8988細胞HDAC1、p21蛋白表達的變化

15、30 nmol/L HDAC1 siRNA組細胞HDAC1蛋白表達明顯低于對照組和c-siRNA組，30 nmol/L HDAC1 siRNA組表達量最低(圖1a)；而p21蛋白表達明顯高于對照組和c-siRNA組，30 nmol/L HDAC1 siRNA組的表達量最高(圖1b)。

1：對照組；2：c-siRNA組；3：15 nmol/L HDAC1 siRNA組；4：30 nmol/L HDAC1 siRNA組

圖1各組PaTu8988細胞HDAC1(a)和p21(b)蛋白的表達

二、PaTu8988細胞周期的變化

兩個HDAC1 siRNA組G2/M期細胞比例均顯著低于對照組和c-siRNA組，S期細胞比例均顯著高于對照組和c-siRNA組(P值均<0.05)；30 nmol/L HDAC1 siRNA組G0/G1期細胞比例顯著低于對照組(P<0.05，表1，圖2)。

表1 各組PaTu8988細胞的細胞周期比例

注：與對照組比較，aP<0.05；與c-siRNA 組比較，bP<0.05

a：對照組，b:c-siRNA組，c:15 nmol/L HDAC1 siRNA組，d:30 nmol/L HDAC1 siRNA組

圖2HDAC1 siRNA干擾對PaTu8988細胞周期的影響

討 論

許多研究發現，HDAC1參與了胃癌、結腸癌、肝癌、前列腺癌等腫瘤的發生發展。應用HDAC抑制劑具有確切的抗增殖和抗腫瘤效果[4-5]。我們先前的研究也顯示抑制HDAC1表達后可抑制胰腺癌細胞增殖、誘導胰腺癌細胞凋亡[3]。

腫瘤細胞增殖抑制和細胞凋亡都與細胞周期受阻密切相關，二者之間存在著復雜和精細的調控網絡。正常細胞往往因為生長周期失控，進而導致細胞惡性轉化和腫瘤形成。不同細胞中HDACs的表達譜是不一樣的，所以去除相同的HDACs在不同的細胞株中可能產生的作用不同[6]。細胞周期是指細胞從一次分裂結束到下一次分裂終了的過程，其中最關鍵的是S期，此期細胞進行DNA倍增和染色體復制。本實驗結果顯示，HDAC1 siRNA瞬間轉染胰腺癌細胞可使G2/M期細胞比例顯著降低，而S期細胞比例顯著增高， G0/G1期細胞比例亦有下降，提示沉默HDAC1基因可引起S期細胞周期阻滯，導致腫瘤細胞DNA倍增和染色體復制抑制，進而阻礙細胞分裂，實現對胰腺癌細胞增殖的抑制作用。

p21是最早被發現的細胞周期素依賴激酶抑制因子(cyclin-dependent kinase inhibitor,CDKI)，CDKI通過與CDK復合物緊密結合，或與CDK直接結合，抑制細胞周期素與CDK結合而實現負調控作用。p21還可通過抑制CDK2/cyclin B激酶復合物的活性引起G2/M期阻滯[6]。HDAC抑制劑可以明顯上調p21的轉錄[7-8]。Lagger等[9]報道,HDAC 1一個重要的增殖相關功能就是抑制p21和p27的異常表達。本結果顯示，siRNA干擾HDAC1后細胞p21蛋白表達增加，提示沉默HDAC1基因是通過上調p21表達而影響細胞周期。

[1] Jones PA, Martienssen R. A blueprint for a human epigenome project: the AACR human epigenome workshop. Cancer Res,2005,65:11241-11246.

[2] Whetstine JR, Ceron J, Ladd B, et al. Regulation of tissue-specific and extracellular matrix-related genes by a class I histone deacetylase.Mol Cell,2005,18:483-490.

[3] 高道鍵,徐岷,張玉琦,等.組蛋白去乙酰化酶1對人胰腺癌細胞增殖凋亡的影響. 中華消化雜志,2009,29:525-528.

[4] Johnstone RW. Histone-deacetylase inhibitors: novel drugs for the treatment of cancer. Nat Rev Drug Discov,2002,1:287-299.

[5] Richon VM, Zhou X, Rifkind RA,et al. Histone deacetylase inhibitors: development of suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA) for the treatment of cancers. Blood Cells Mol Dis, 2001,27:260-264.

[6] Roninson IB. Oncogenic functions of tumour suppressor p21(Waf1/Cip1/Sdi1): association with cell senescence and tumour-promoting activities of stromal fibroblasts. Cancer Lett,2002,179:1-14.

[7] Varshochi R, Halim F, Sunters A, et al. ICI182,780 induces p21Waf1 gene transcription through releasing histone deacetylase 1 and estrogen receptor alpha from Sp1 sites to induce cell cycle arrest in MCF-7 breast cancer cell line. J Biol Chem,2005,280:3185-3196.

[8] Davie JR. Inhibition of histone deacetylase activity by butyrate. J Nutr,2003,133:2485S-2493S.

[9] Lagger G, O′Carroll D, Rembold M, et al. Essential function of histone deacetylase 1 in proliferation control and CDK inhibitor repression. Embo J,2002,21:2672-2681.

2010-11-29)

(本文編輯：屠振興)

Effectsofhistonedeacetylase1genesilencingoncellcycleregulationofpancreaticcancercelllinePaTu8988

GAODao-jian,MANXiao-hua,XUMin,ZHANGYu-qi,GAOJun,GONGYan-fang,WUHong-yu,JINJing,XUGou-ming,LIZhao-shen.

DepartmentofEndoscopy,EasternHepatobiliarySurgeryHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200438,China

LIZhao-shen,Email:lizhaoshench@gmail.com

ObjectiveTo investigate the effects of histone deacetylase 1 (HDAC1) gene silencing on cell cycle of pancreatic cancer cell line PaTu8988 and possible mechanism.MethodsThe PaTu8988 cells were routinely cultured and divided into control group, negative control siRNA group (c-siRNA), HDAC1 siRNA 15 nmol/L group and HDAC1 siRNA 30nmol/L group. After Liposomes 2000 transfection for 48 h, the Western blotting was used to detect the efficiency of HDAC1 gene silencing on protein levels and the expression of p21 protein. Cell cycle was evaluated by using flow cytometry.ResultsCompared with that of control group, the expression of HDAC1 protein in PaTu8988 cell of HDAC1 siRNA 30nmol/L group was significantly decreased, and the expression of p21 protein was significantly increased; the percentage of G2/M phase cells were significantly decreased [(21.48±3.67)%vs. (28.28±2.94) %,P<0.05]; while the percentage of S phase cells were significantly increased [(50.20±6.85)%vs. (32.49±2.78)%,P<0.05].ConclusionsHDAC1 siRNA can efficiently and specifically inhibit the expression of HDAC1 in PaTu8988 cells, and can induce S phase cells arrest, which may be related with up-regulation of p21 protein expression.

Pancreatic neoplasms; Histone deacetylases; RNA interference; Cell cycle

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.05.004

重大國際合作項目(30910103911)

200438 上海，第二軍醫大學附屬東方肝膽外科醫院內鏡科(高道鍵)；第二軍醫大學長海醫院消化內科(滿曉華、徐岷、張玉琦、高軍、龔燕芳、吳紅玉、金晶、許國銘、李兆申)

李兆申，Email: lizhaoshench@gmail.com