JNK信號通路在急性壞死性胰腺炎大鼠相關性肺損傷中的作用

石亮亮 劉明東 朱浩 陳敏 鄒曉平

·論著·

JNK信號通路在急性壞死性胰腺炎大鼠相關性肺損傷中的作用

石亮亮 劉明東 朱浩 陳敏 鄒曉平

目的探討JNK信號通路在重癥急性胰腺炎相關性肺損傷中的作用。方法24只大鼠按數字表法隨機分為假手術組和急性壞死性胰腺炎(ANP)組，采用膽總管逆行注射5%牛磺膽酸鈉建立ANP大鼠模型。制模后12、24 h處死大鼠，取胰腺、肺組織行常規病理檢查；采用ELISA法檢測肺組織TNF-α和IL-1β含量；實時PCR和蛋白質印跡法檢測肺組織JNK mRNA和蛋白的表達。結果ANP組大鼠胰腺組織出血、壞死，大量炎細胞浸潤；肺組織水腫，肺實變、間質水腫，炎癥細胞浸潤。ANP組24 h時肺組織TNF-α、IL-1β含量及JNK mRNA、JNK蛋白、磷酸化JNK表達量分別為(374.3±124.0)pg/ml、(649.0±114.9)pg/ml、2.57±0.76、1.40±0.81、0.81±0.20，均較假手術組的(218.2±68.4)pg/ml、(524.3±58.4)pg/ml、1.03±0.11、0.32±0.11、0.32±0.11顯著增加(P值均<0.05)。結論JNK信號通路在實驗性ANP相關肺損傷中起著一定作用。

胰腺炎，急性壞死性； 肺損傷； JNK絲裂原活化蛋白激酶類

急性胰腺炎是臨床常見的內科疾病，其中重癥急性胰腺炎(SAP)約占20%，其病程兇險，常伴有全身炎癥反應綜合征和多器官功能不全[1]，其中急性胰腺炎相關性肺損傷(acute pancreatitis-associated lung injury，APALI)最為常見，是SAP患者早期病死的最主要的原因[2]。本研究旨在探討c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal kinase, JNK)在APALI發生中的作用。

材料與方法

一、實驗動物及分組

雄性SD大鼠(200～250 g)24只，清潔級，購自南京鼓樓醫院實驗動物中心。適應性飼養1周后按數字表法隨機分為急性壞死性胰腺炎(ANP)組和假手術組，各12只。大鼠術前禁食12 h，自由飲水。給予氯胺酮腹腔注射麻醉(120 mg/ kg)，采用5%牛磺膽酸鈉1. 0 ml/kg體重劑量十二指腸乳頭逆行注入膽胰管的方法建立大鼠ANP模型。假手術組大鼠開腹后僅翻動十二指腸并觸摸胰腺數次后關腹。術后12、24 h分批處死大鼠，取血及胰腺、肺組織。

二、檢測指標

1．胰腺、肺組織病理學檢查：取大鼠胰腺組織和右側部分肺葉置于10%中性甲醛中固定24 h，常規石蠟包埋、切片、HE染色、顯微鏡下觀察。

2．肺組織TNF-α和IL-1β含量測定：取部分右肺組織制成5%的勻漿液，-20℃保存。用ELISA方法測定肺組織勻漿液的TNF-α和IL-1β含量，按試劑盒(美國Bender公司)說明書操作。

3．肺組織JNK mRNA檢測：采用實時PCR方法檢測。以Trizol試劑抽提肺組織總RNA，分光光度計檢測RNA純度及濃度。應用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄合成cDNA。JNK上游引物5′-ATTTGG-AGGAGCGAACTAAG-3′，下游引物5′-ATTGAC-AGACGGCGAAGA-3′，擴增片段112 bp；內參β-actin上游引物5′-TCGTGCGTGACATTAAAGAG-3′，下游引物5′-ATTGCCGATAGTGATGACCT-3′，擴增片段134 bp，引物由Invitrogen公司合成。在ABI PRISM 7500熒光實時定量PCR儀上行擴增反應。反應條件： 95℃ 10 s，95℃ 5 s、60℃ 34 s，45個循環；溶解曲線分析：95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s。每個樣本重復3次，取Ct的平均值，采用相對定量2-△△Ct法計算mRNA表達量。

4．JNK和磷酸化JNK(p-JNK)蛋白檢測：采用蛋白質印跡法檢測。取肺組織，剪碎后按100 mg組織加0.5 ml RIPA裂解液比例制備組織勻漿，離心取上清，常規行蛋白質印跡法，最后ECL發光，X線片曝光、顯影、定影、掃描。以GAPDH蛋白作為內參。用Quantity One軟件分析，目標條帶與內參條帶的灰度比值表示蛋白相對表達量。

三、統計學方法

結 果

一、胰腺、肺組織病理學改變

假手術組大鼠胰腺、肺組織結構正常。ANP組12 h時胰腺腺泡間隙明顯擴大，小葉結構破壞，胰腺內出現片狀壞死，大量中性粒細胞浸潤；24 h時胰腺壞死區域進一步擴大，中性粒細胞浸潤相對減輕。ANP組12 h時可見肺組織實性變和部分囊泡樣變，間質毛細血管充血、淤血，大量中性粒細胞浸潤；24 h時肺組織實變更嚴重(圖1)。

圖1ANP組12 h時胰腺(a)及肺組織(b)的病理改變(HE ×100)

二、肺組織TNF-α、IL-1β含量的變化

ANP組肺組織中TNF-α及IL-1β隨時間延長而增加，其中TNF-α在12 h時就較假手術組顯著升高，IL-1β在24 h時才較假手術組顯著升高(P值均<0.05，表1)。

三、肺組織JNK mRNA表達的變化

ANP組肺組織JNK mRNA的表達較假手術組顯著增加(P<0.05，表1)。

四、JNK和p-JNK蛋白表達的變化

ANP組JNK及p-JNK蛋白的表達均較假手術組顯著升高(P值均<0.05)，其中12 h時p-JNK升高較24 h更明顯(P<0.05，表1)。

表1 兩組TNF-α、IL-1β含量及JNK、JNK mRNA表達的變化

注：與假手術組同時點比較，aP<0.05；與ANP 24 h組比較，bP<0.05

討 論

急性胰腺炎并發的急性肺損傷的發病機制至今尚未完全闡明，現在較為公認的是“二次打擊”學說，認為過度炎癥反應激活效應細胞并釋放炎性介質在其中起了重要作用。中性粒細胞可以產生多種炎性介質、氧自由基、蛋白水解酶等毒性物質，其中TNF-α和IL-1是最重要的細胞因子。IL-1是細胞因子網絡中最早釋放的炎性介質之一，細胞毒性很強，而且可促發細胞因子網絡“瀑布效應”，引起嚴重的組織細胞損傷。TNF-α作為重要的始發因子作用于多種細胞，激發一系列級聯反應誘導IL-1、IL-6、IL-8等基因表達，TNF-α還可作用于中性粒細胞促進自身的產生，使炎癥瀑布反應放大，增強其破壞作用[3]。本實驗結果顯示， ANP大鼠肺組織可見大量中性粒細胞浸潤，同時肺組織中TNF-α和IL-1β含量增加，證實了炎癥因子在肺損傷中的重要作用。

文獻報道，NF-κB和環氧合酶-2對這些細胞因子具有調控作用，在APALI的發病中起著重要的作用[4-5]。但是人們用相應拮抗劑治療，只能部分緩解APALI的病理損傷程度，降低細胞因子的水平，并不能完全改善APALI的病理損傷，這就說明在APALI的發病過程中還存在其他機制。絲裂原激活蛋白激酶(MAPKs)是介導細胞外信號引起細胞內反應的信號轉導系統，是調節產生細胞因子(如TNF-α、IL-6、IL-1β等)、黏附分子(如ICAM-1等)和趨化因子的主要信號轉導通路。JNK是MAPKs家族的重要成員之一[6]，在缺血再灌注肺損傷中起著重要作用[7]。本結果顯示，ANP組大鼠肺組織JNK mRNA和蛋白表達增加，p-JNK表達也增加，提示在APALI過程中JNK信號通路被激活。

由此可見，ANP并發肺損傷時，炎癥因子TNF-α、IL-1β的表達增加，導致JNK信號通路激活，從而激活下游通路，促進炎癥因子的產生，引發“瀑布效應”。因此，通過阻斷JNK通路的激活，可以抑制炎癥反應的擴大。

[1] Chan YC,Leung PS.Acute pancreatitis:animal models and recent advances in basic research.Pancreas,2007,34:1-14.

[2] Bumbasirevie V, Radenkovic D, Jankovic Z, et al.Severe acute pancreatitis: overall and early versus late mortality in intensive care units.Pancreas,2009,38:122-125.

[3] Ertel W, Morrison MH, Wang P, et al.The complex pattern of cytokines in sepsis.Association between protaglandins,cachectin,and interleukins.Ann Surg,1991,214:141.

[4] Ethridge RT, Hashimoto K, Chung DH, et al.Selective inhibition of NF-kappaB attenuates the severity of cerulein-induced acute pancreatitis. J Am Coll Surg,2002,195:497-505.

[5] Song AM,Bhagat L,Singh VP,et al.Inhibition of cyclooxygenase-2 ameliorates the severity of pancreatitis and associated lung injury.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2002,283:G1166-1174.

[6] Tateda K, Deng JC, Moore TA, et al.Hyperoxia mediates acute lung injury and increased lethality in murine legionella pneumonia:the role of apoptosis.J Immunol,2003,170:4209-4216.

[7] Ishii M, Suzuki Y, Takeshita K, et al. Inhibition of c-Jun NH2-terminal kinase activity improves ischemia/reperfusion injury in rat lungs.J Immunol, 2004,15,172:2569-2577.

2010-11-12)

(本文編輯：呂芳萍)

JNKsignalpathwayinacutenecrotizingpancreatitisassociatedlunginjuryinrats

SHILiang-liang,LIUMing-dong,ZHUHao,CHENMin,ZOUXiao-ping.

Departmentofgastroenterology,DrumTowerHospital,MedicalSchool,NanjingUniversity,Nanjing210008,China

ZOUXiao-ping,Email:zouxiaoping795@hotmail.com

ObjectiveTo investigate the effect of JNK signal pathway in acute necrotizing pancreatitis(ANP) associated lung injury.MethodsA total of 24 SD rats were randomly divided into sham group and ANP group, ANP rats were induced by retrograde injection of 5% sodium taurocholate into common bile duct. The rats were sacrificed 12 and 24h later, and the pancreas and lung tissue were resected and underwent routine pathologic examination, ELISA method was used to detect the level of TNF-α and IL-1β in lung tissue. Expression of JNK mRNA was detected by real time PCR, and the expression of JNK protein were evaluated by Western blotting.ResultsThere was bleeding, necrosis, large amount of inflammatory cells infiltration in pancreatic tissue; and there was edema, pulmonary consolidation, interstitial edema, inflammatory cells infiltration in lung tissue in ANP group. The levels of TNF-α and IL-1β, JNK mRNA, JNK protein, phosphorylation JNK were (374.3±124.0)pg/ml, (649.0±114.9)pg/ml, 2.57±0.76, 1.40±0.81, 0.81±0.20 in ANP group, which were significantly higher than those in with sham group [(218.2±68.4)pg/ml, (524.3±58.4)pg/ml, 1.03±0.11, 0.32±0.11, 0.32±0.11,P<0.05].ConclusionsJNK signal pathway plays an important role in experimental ANP associated lung injury in rats.

Pancreatitis, acute necrotizing; Lung injury; JNK mitogen-activated protein kinases

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.05.010

210008 南京，南京大學醫學院附屬鼓樓醫院消化科

鄒曉平，Email：zouxiaoping795@hotmail.com