分辨魔角旋轉核磁共振波譜在大鼠慢性胰腺炎分級中的應用

田冰 陸建平 馬超 楊根金 黃文才 汪劍 蔣斐 蘇曉菊 王小瑋

·論著·

分辨魔角旋轉核磁共振波譜在大鼠慢性胰腺炎分級中的應用

田冰 陸建平 馬超 楊根金 黃文才 汪劍 蔣斐 蘇曉菊 王小瑋

目的觀察大鼠實驗性慢性胰腺炎(CP)進展過程中胰腺組織代謝產物變化特征，探討其在CP分級中的價值。方法Wistar大鼠36只，經尾靜脈注入二丁基二氯化物(dibutyltin dichloride,DBTC)溶液8 mg/kg體重制備CP模型。注射后即刻(對照組)及7、14、21、28、35 d分批取大鼠胰腺組織，小部分行病理檢查，大部分液氮冷凍后置-80℃保存。應用高分辨魔角旋轉核磁共振波譜(HR-MAS NMR)法檢測胰腺組織的代謝產物。以非正常結構、管狀復合物、腺體萎縮、纖維化、水腫及炎細胞浸潤程度等作為基本指標進行病理分級。結果胰腺組織的病理損傷嚴重程度隨造模時間的推移逐漸增加，造模后7、14 d大鼠胰腺改變為輕度CP，造模后21、28、35 d大鼠胰腺病理改變為重度CP。重度CP大鼠胰腺組織中甜菜堿(Bet)、膽堿(Cho)化合物含量較輕度CP組及對照組大鼠明顯增多，而天冬氨酸鹽(Asp)、乳酸(Lac)、脂肪酸(FA)、異亮氨酸/亮氨酸/纈氨酸(Ile/Leu/Val)的含量明顯減少。輕度CP與對照組大鼠胰腺組織的代謝產物含量無明顯差異。結論應用HR-MAS NMR分析胰腺組織代謝產物有助于區分重度CP與輕度CP。

胰腺炎，慢性; 魔角旋轉; 核磁共振波譜學; 代謝

慢性胰腺炎(CP)是臨床較為常見的消化系統疾病之一。目前采用的CP分級標準多基于臨床表現、實驗室檢查及影像學表現等[1],缺乏從代謝層面對CP不同病程階段的代謝特征進行分析。高分辨魔角旋轉核磁共振波譜(high-resolution magic angle spinning nuclear magnetic resonance spectroscopy，HR-MAS NMR)是一種無創的離體組織代謝成分的分析方法[2]，具有較高的靈敏度，可以較準確地分析組織內各類化合物。本研究應用HR-MAS NMR分析CP大鼠不同時期的代謝特征變化，探究HR-MAS NMR在大鼠CP分級中的價值。

材料與方法

一、大鼠CP模型的建立

雄性Wistar大鼠36只，由第二軍醫大學實驗動物中心提供，體重約為250 g。采用經尾靜脈注入二丁基二氧化物溶液200 μl(8 mg/kg 體重)[3]方法造模，造模后即刻(對照)及7、14、21、28、35 d分批開腹，小心剝離胰腺，大體觀察胰腺外形，然后將小部分胰腺置福爾馬林液固定，大部分胰腺置液氮保存。

二、胰腺病理學檢查

固定的CP胰腺組織常規病理切片，HE染色，由2位資深病理學專家采用雙盲法鏡下觀察，并參照文獻[4]標準評定炎癥分級。

三、HR-MAS NMR分析

BRUKER AVANCE-600譜儀由第二軍醫大學藥學院提供。取CP胰腺組織中間部分約15 mg，氘水清洗后裝入4 mm附帶球形內腔的ZrO2樣品管進行NMR實驗，1H共振頻率為600.13 MHz。測試用探頭為HR/MAS探頭，魔角旋轉速度為5 KHz，測試溫度為300.0 K，實驗譜寬為12.02 KHz，采樣次數160，恢復時間2 s，采樣時間2.5 s，一維1H譜采用預飽和法壓制水峰的CPMG脈沖序列，總回波時間180 ms，回波次數30，組織內的大分子及一些短自旋-自旋弛豫時間(T2)代謝物的質子信號被壓制。結合二維1H-1H COSY，1H-1H TOCSY實驗結果對主要代謝物的譜峰進行指認。

利用BRUKER公司Topspin3.0程序對實驗數據進行傅立葉變換，并進行相應的相位及基線校正。一維質子CPMG實驗數據用1.31ppm處的脂肪峰進行定標(fat acid,FA)，取0.5～4.6 ppm范圍。利用附帶的AMIX 軟件進行降維簡化處理，即對實驗數據組進行主成分(principal component analysis, PCA)處理，獲得積分(scores)圖和與積分圖相對應的負載(loadings)圖，分析胰腺內代謝物的差異，并用Topspin3.0程序計算典型代謝物在CPMG譜圖中對應的積分面積。

結 果

一、胰腺病理形態學改變及分級

造模后2 d內大鼠死亡1只(7 d組)。對照組大鼠胰腺組織呈粉紅色，質地均勻細膩，胰管纖細可見；造模后7、14 d組大鼠胰腺輕度水腫，胰管輕度擴張；造模21 d后各組大鼠胰腺明顯水腫，胰管明顯擴張，并逐漸出現萎縮，表面欠規則。鏡下見對照組大鼠胰腺無明顯異常；7、14 d組大鼠胰腺組織內中性粒細胞、單核細胞、成纖維細胞浸潤，腺泡細胞腫脹、散在點狀壞死，間質見少量纖維組織沉積，為輕度CP；21 d后各組大鼠胰腺組織內炎性細胞大量浸潤，大量纖維結締組織增生，胰腺小葉結構破壞，為重度CP。各組均未見明確的管狀復合物出現(圖1)。

圖1對照組(a)、輕度CP組(b)及重度CP組(c)胰腺組織病理改變(HE ×200)

二、HR-MAS NMR分析結果

對照組、輕度及重度CP組的HR-MAS NMR見圖2，化學位移為0.7～4.6 ppm，脈沖序列為CPMG。積分圖顯示，重度CP數據點較為緊密，且與輕度CP及對照組數據分離有明顯差異，而輕度CP與對照組間差異不明顯。由負載圖(圖3)顯示造成差異的主要代謝物甜菜堿(Bet)，磷酸膽堿/甘油磷酸膽堿(PC/GPC),天冬氨酸鹽(Asp)，乳酸(Lac),脂肪酸(FA)及異亮氨酸/亮氨酸/纈氨酸(Ile/Leu/Val)。各組不同代謝產物積分面積(表1)顯示重度CP組大鼠胰腺代謝物中Bet、PC/GPC、膽堿(Cho)含量較對照組明顯增多，而Asp、Lac、FA、Ile/Leu/Val的含量明顯減少。

圖2 大鼠正常胰腺和CP胰腺離體組織HR-MAS NMR波譜

圖3 胰腺組織的積分圖(左)與相應的負載圖(右)

CP是由多種原因造成的胰腺局部、階段或彌漫性炎癥。影像學檢查在CP診斷、分級、療效評估等方面起著非常重要的作用。磁共振波譜分析(MRS)是一種基于核磁共振現象和化學位移作用對非特定的原子核及化合物進行分析的一種方法，能夠無創地對在體器官、組織進行化合物定量分析。隨著MRS技術的迅速發展，高場強MRI-MRS一體化裝置的問世和MRS靈敏度的不斷提高，MRS無論在臨床診斷，還是實驗室研究都得到越來越多的應用。目前臨床應用的1.5T或3.0T磁共振成像儀可以直接對胰腺組織及病變組織進行MRS分析，但由于磁場強度較低，空間分辯率較低，易受腹腔其他臟器、呼吸偽影及運動偽影峰干擾，所獲得的代謝物信息較少。Cho等[5]的研究結果只發現一個有差異的特征性代謝產物。HR-MAS NMR可以不對樣品進行任何物理或化學處理。如果條件合適，可以把手術切除的標本直接用于HR-MAS檢測，而且使用樣品體積少(10～20 mg)，能100%地置于檢測線圈內，磁化率均勻，靈敏度很高，近年來在生物醫學領域得到廣泛應用[6]。

尾靜脈注射二丁基二氯化物誘導的大鼠CP以進展性纖維組織沉積為主要特征，與人類CP病程極為相似[3]。本實驗結果顯示，重度CP大鼠的胰腺組織代謝物與對照組及輕度CP大鼠差異較大，其中Bet、PC/GPC、Cho代謝物含量明顯增多，而Asp、Lac、FA、Ile/Leu/Val的含量明顯減少。Bet是Cho的產物，作為一種高效的甲基供體，參與細胞內的甲基轉移，膽堿化合物主要包括Cho、PC、GPC，是細胞膜磷脂代謝的主要成分，參與細胞膜的合成與降解。Lac與糖酵解密切相關，Ile/Leu/Val屬于支鏈氨基酸，人體不能合成，必須從外界攝取。重度CP時，胰腺實質壞死伴發炎性反應，繼而各種炎性因子釋放并激活胰腺星狀細胞，使之轉化為成纖維細胞，后者增殖并合成細胞外基質，導致膽堿化合物及Cho的產物Bet明顯增加[7]。

表1 各組大鼠離體胰腺組織不同代謝產物的積分面積

[1] Schneider A,Lohr JM,Singer MV. The M-ANNHEIM classification of chronic pancreatitis: introduction of a unifying classification system based on a review of previous classifications of the disease. J Gastroenterol,2007,42:101-119.

[2] Chen JH,Sambola EB,Kennealey PT,et al.Water suppression without signal loss in HR-MAS 1H NMR of cells and tissues.J Magn Reson,2004,171:143-150.

[3] 何新紅,陸建平,廖專,等.二丁基二氯化物尾靜脈注射建立大鼠慢性胰腺炎模型.胰腺病學，2007,7:17-20.

[4] van Westerloo DJ,Floquin S,de Bore AM, et al.Therapeutic effects of troglitazone in experimental chronic pancreatitis in mice. Am J Pathol,2005,166:721-728.

[5] Cho SG,Lee DH,Lee KY,et al.Differentiation of chronic focal pancreatitis from pancreatic carcinoma by in vivo proton magnetic resonance spectroscopy.J Comput Assist Tomogr,2005,29:163-169.

[6] Prati D,Shiffman ML,Diago M,et al.Viral and metabolic factors influencing alanine aminotransferase activity in patients with chronic hepatitis C.J Hepatol,2006,44:679-685.

[7] 張汝玲，王興鵬.慢性胰腺炎胰腺纖維化發生機制及抗纖維化治療進展.胰腺病學，2001,1：56-58.

2011-01-17)

(本文編輯：呂芳萍)

High-resolutionmagicanglespinningnuclearmagneticresonancespectroscopicinthegradingofchronicpancreatitisinrats

TIANBing,LUJian-ping,MAChao,YANGGen-jin,HUANGWen-cai,WANGJian,JIANGFei,SUXiao-ju,WANGXiao-wei.

DepartmentofRadiology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200438,China

LUJian-ping,Email:cjr.lujianping@vip.163.com

ObjectiveTo observe the metabolic characteristics of an experimental model of chronic pancreatitis, and to investigate its role in the grading of chronic pancreatitis.MethodsThirty-six Wistar rats were injected with dibutyltin chloride (DBTC) solution (8mg/kg) via the tail vein to establish the experimental model of chronic pancreatitis. The 36 rats were divided into 6 groups with 6 rats in each group. On 0, 7, 14, 21, 28, 35 days after modeling, rats was sacrificed and pancreatic tissue of the rats was harvested, and a small part was used for pathologic study, the majority part was kept at -80℃ under liquid nitrogen freezing. Metabolites of pancreatic tissue were determined by high-resolution magic angle spinning nuclear magnetic resonance spectroscopic (HR-MAS NMRS). On the basis of the abnormal structure, tubular complexes, gland atrophy, fibrosis, edema and inflammatory cell infiltration, chronic pancreatitis was graded.ResultsPathologic study showed the severity of chronic pancreatitis gradually increased with time after modeling. The 7th, 14th day after modeling, the pancreatic change was mild chronic pancreatitis; the 21st, 28th, 35th day, the pancreatic change was changed into severe chronic pancreatitis. Principal component analysis of HR-MAS NMRS showed that the betaine (Bet) and choline (Cho)-contained components were significantly increased in severe chronic pancreatitis; while aspartate (Asp), lactate (Lac), isoleucine/leucine/valine (I/L/V) and fatty acid (FA) were significantly reduced when compared with those in mild chronic pancreatitis and normal pancreatic tissue. There was no significant difference in the amount of metabolic characteristics between mild chronic pancreatitis and normal pancreatic tissue.ConclusionsHR-MAS NMRS was helpful in distinguishing the severe chronic pancreatitis from mild chronic pancreatitis.

Pancreatitis, chronic; Magic angle spinning; Magnet resonance spectroscopy; Metabolism

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.05.011

國家自然科學基金(30870709)

200433 上海，第二軍醫大學長海醫院醫學影像科(田冰、陸建平、馬超、黃文才、汪劍)，消化內科(蔣斐、蘇曉菊、王小瑋)；第二軍醫大學藥學院分析測試中心(楊根金)

陸建平，Email:cjr.lujianping@vip.163.com