胰性腦病水通道蛋白-4的表達及意義

趙嚴 秦海麗 胡國勇 郭傳勇 王興鵬

·論著·

胰性腦病水通道蛋白-4的表達及意義

趙嚴 秦海麗 胡國勇 郭傳勇 王興鵬

目的觀察水通道蛋白4(AQP4)在磷脂酶A2誘導(dǎo)的胰性腦病(PE)大鼠腦組織中的表達變化，探討AQP4與胰性腦病的關(guān)系。方法25只健康成年Wistar大鼠按數(shù)字表法隨機分為空白組(5只)、對照組(10只)和PE組(10只)，應(yīng)用磷脂酶A2頸內(nèi)動脈注射(0.1ml/100g體重)方法建立大鼠PE模型。對照組注射等容積生理鹽水；空白組無任何處理。注射后1 d處死大鼠，測腦濕/干重比值，常規(guī)行腦組織病理檢查，采用免疫組化法和蛋白質(zhì)印跡法檢測AQP4的表達。結(jié)果空白組、對照組大鼠腦組織無明顯病理改變，PE組大鼠腦組織內(nèi)神經(jīng)元明顯水腫,呈氣球樣變, 炎細胞浸潤、聚集，微血管內(nèi)白細胞聚集及附壁。空白組、對照組、PE組大鼠腦組織含水量分別為(61.44±0.36)%、(63.20±0.32)%和(78.33±0.24)%，PE組大鼠腦組織含水量明顯增加(P<0.05)；腦組織AQP4相對表達量分別為0.41±0.27、0.49±0.13、0.98±0.21，PE組大鼠腦組織AQP4表達明顯上調(diào)(P<0.05)。結(jié)論AQP4可能參與胰性腦病的發(fā)病機制。

胰腺炎，急性壞死性； 胰性腦病； 水通道蛋白-4

胰性腦病(pancreatic encephalopathy，PE)是重癥急性胰腺炎(SAP)病程中出現(xiàn)的嚴重并發(fā)癥,發(fā)病率為18.2%,病死率為67.0%[1]。它主要表現(xiàn)為意識模糊,定向力障礙,激動伴妄想、幻覺等腦神經(jīng)癥狀。胰酶是引起胰性腦病的最主要原因之一，尤其是磷脂酶A2(phospho lipase A2, PLA2)起重要作用。另外,PE時常出現(xiàn)腦組織脂溶性脫髓鞘化，多灶性小動脈或毛細血管壞死、出血, 血管周圍及神經(jīng)元水腫等現(xiàn)象[2-3]。本研究觀察PE大鼠腦組織含水量和水通道蛋白4(aquaporins，AQP4)的變化，探討AQP4在胰性腦病發(fā)病機制中的作用，以望為胰性腦病臨床治療尋求新的有效方法。

材料和方法

一、大鼠分組及胰性腦病模型建立

成年Wistar大鼠，雌雄不限，體重200～250 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司。按數(shù)字表法隨機分為空白組(5只)、對照組(10只)、PE組(10只)。實驗前大鼠禁食12 h，自由飲水。參照苗毅等[4]方法，從頸內(nèi)動脈注入10 000 U/ml的PLA2(Sigma公司)0.1 ml/100 g體重方法復(fù)制大鼠PE模型，注射速度為0.05 ml/min；對照組大鼠同樣速度注入生理鹽水0.1 ml/100 g體重；空白組不予處理。注射后1 d以1%氯氨酮(1 ml/100 g體重)腹腔注射麻醉后,腹主動脈放血處死動物并取腦。右側(cè)腦一半置4%甲醛-鈣中固定保存，另一半垂直于中線方向切成2份，額葉制備組織勻漿，枕葉用于測重。

二、腦組織含水量測定

將鼠腦的枕葉放在事先稱重的載玻片上稱濕重，然后置80℃烤箱36 h烤干，測鼠腦的干重[3]。腦組織含水量=(濕重-干重)÷濕重×100%。

三、腦組織AQP4蛋白檢測

取固定的右腦組織，常規(guī)脫水、包埋、切片，采用免疫組化S-P法檢測組織AQP4含量。以PBS代替一抗作為陰性對照。按照免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)說明書操作。

取約200 mg額葉腦組織置玻璃勻漿器內(nèi)，加入2 ml的RIPA裂解液制成勻漿。置冰浴30 min,4℃ 8000 r/min離心10 min,取上清,應(yīng)用BCA法定量蛋白。取50 μg常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法。兔抗大鼠AQP4單抗和β-actin單抗購自Santa Cruz公司，ECL購自美國Santa Cruz 公司。最后用Bio-Rad2000凝膠圖像處理系統(tǒng)分析。目的條帶與內(nèi)參β-actin條帶灰度值比值作為蛋白相對表達量。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、大鼠表現(xiàn)

空白組、對照組大鼠于麻醉清醒后即開始進食，活動不受影響；PE組大鼠進食減少，活動減少，反應(yīng)遲鈍，抓捕反射減弱。

二、腦組織含水量

空白組、對照組、PE組大鼠腦組織含水量分別為(61.44±0.36)%、(63.20±0.32)%和(78.33±0.24)%。PE組大鼠腦組織含水量明顯高于空白組及對照組(P<0.05),而空白組和對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

三、腦組織病理變化

空白組、對照組大鼠腦組織可見散在的神經(jīng)元水腫，無炎細胞浸潤、聚集,腦組織微血管內(nèi)有少數(shù)白細胞附壁。PE組大鼠腦組織內(nèi)神經(jīng)元明顯水腫,呈氣球樣變,炎細胞浸潤、聚集，微血管內(nèi)白細胞聚集及附壁(圖1左)。

四、腦組織AQP4表達

空白組、對照組、PE組大鼠腦組織均有AQP4表達，定位于胞膜，胞質(zhì)及胞核未著色(圖1右)。經(jīng)蛋白質(zhì)印跡法檢測，空白組、對照組、PE組大鼠腦組織AQP4相對表達量分別為0.41±0.27、0.49±0.13、0.98±0.21，PE組大鼠腦組織AQP4表達明顯上調(diào)(P<0.05，圖2) 。

討 論

Lowell于1923年首先在臨床觀察中提出PE主要表現(xiàn)為精神神經(jīng)障礙。盡管經(jīng)過幾十年的臨床和基礎(chǔ)研究, PE發(fā)病確切機制仍然不十分明確。由于PE無可靠生物化學(xué)診斷指標，易誤診或漏診。近年來AQPs引起人們的關(guān)注，其在水分子的跨膜轉(zhuǎn)運方面起著關(guān)鍵性作用。迄今為止發(fā)現(xiàn)的AQPs亞型共有7種，包括AQP1、AQP3、AQP4、AQP5、AQP8、AQP9和AQP11。分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要是AQP4和AQP1，其中以AQP4分布最為廣泛。目前對腦內(nèi)AQPs家族的研究主要集中于AQP4，它是腦內(nèi)含量最多的水通道蛋白，主要分布于星形膠質(zhì)細胞和室管膜細胞、脈絡(luò)叢，尤其富集于毛細血管和軟腦膜直接接觸的膠質(zhì)細胞中，覆蓋超過95%腦毛細血管面。這種特性提示AQP4在維持大腦水平衡中起重要作用，是膠質(zhì)細胞與腦脊液以及血管間水調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)運的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，可能參與腦脊液重吸收、滲透壓調(diào)節(jié)， 還可能兼有細胞外滲透壓感受器和水平衡調(diào)節(jié)器的功能[5]。AQP4與腦水腫關(guān)系密切，參與出血性、缺血性腦水腫形成。

圖1空白組(a)、對照組(b)、PE組(c)大鼠腦組織病理改變(左)及AQP4表達(右) (HE ×400；免疫組化 ×200)

圖2 空白組、對照組、PE組大鼠腦組織AQP4蛋白表達

本研究采用PLA2復(fù)制PE模型，結(jié)果顯示大鼠腦組織含水量明顯增加，神經(jīng)元明顯水腫，呈氣球樣變，炎細胞浸潤，微血管內(nèi)白細胞聚集及附壁，證實PLA2對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒性作用。經(jīng)免疫組化及蛋白質(zhì)印跡法測定腦組織AQP4表達，結(jié)果顯示PE組AQP4表達明顯增強，提示AQP4參與了PE腦水腫的損傷過程。PE發(fā)生后AQP4表達上調(diào)的機制可能與血腦屏障完整性的破壞相關(guān)，因為血腦屏障膠質(zhì)細胞足突上AQP4表達升高，可引起血管內(nèi)水分子透過血腦屏障進入腦組織，引發(fā)腦水腫[6]。

[1] 汪謙，李湘 ．SAP患者胰性腦病的研究進展.中國實用外科雜志，2004，24：63-64．

[2] 楊宏楷，翟建，陳遠軍，等.遲發(fā)性胰性腦病的MRI診斷.中華神經(jīng)外科疾病研究雜志,2009, 8：153-156.

[3] 趙海平，呂飛飛，歐陽曉暉.丙二醛、超氧化物歧化酶及腫瘤壞死因子-α在大鼠實驗性胰性腦病中的作用.中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志，2008,15:337-341.

[4] 苗毅, 錢祝銀, 劉訓(xùn)良,等. 胰性腦病動物模型的制備.中華實驗外科雜志,1997,14:235.

[5] Lee NY, Blobe GC. The interaction of endoglin with beta arrestin 2 regulates transforming growth factor beta mediated ERK activation and migration in endothelial cells. J Biol Chem,2007,282:215007-215017.

[6] Zeynalov E, Chen CH, Froehner SC, et al. The perivascular pool of aquaporin-4 mediates the effect of osmotherapy in postischemic cerebral edema. Crit Care Med,2008,36:2634-2640.

2011-01-04)

(本文編輯：屠振興)

Expressionofaquaporins-4inbraintissueofratswithpancreaticencephalopathy

ZHAOYan,QINHai-li,HUGou-yong,GUOChuan-yong,WANGXing-peng.

DepartmentofGastroenterology,ShanghaiTenthPeople′sHospital,SchoolofMedicine,TongjiUniversity,Shanghai200072,China

WANGXing-peng,Email:wangxp1965@yahoo.com.cn

ObjectiveTo study the expression of aquaporins-4 (AQP4) in the brain tissue of rats with pancreatic encephalopathy (PE) induced by phospholipase A2 and to explore the role of aquaporins-4 in PE．MethodsTwenty five healthy Wistar rats were randomized into 3 groups: blank group (n=5), PE group (n=10) and control group (n=10). The experimental model was established in rats by injecting phospholipase A2 into carotid artery (0.1 ml/100 g body weight). Same amount of normal saline was used in the control group and no treatment was used in the blank group. One day later, the rats were sacrificed, then the measurement of brain tissue wet/dry (W/D) weight ratio was performed, and brain tissue was routinely pathologically examined, immunohistochemistry and Western blotting were performed in each group to detect the expression of aquaporins-4．ResultsThere was no obvious brain tissue pathological change in the control group and blank group. Neurons in the brain tissue of PE rats presented with significant edema and ballooning degeneration, infiltration of inflammatory cells, leukocyte aggregation around the microvessels. The water contents in the brain tissue in the blank group and control group, PE group were (61.44±0.36)%, (63.20±0.32)% and (78.33±0.24)%, and it was significantly higher in PE group than that in the control and blank group (P<0.05)．The expressions of aquaporins-4 in the brain tissue were 0.41±0.27, 0.49±0.13, 0.98±0.21, respectively, and it was significantly increased in PE group than that in the control and blank group (P<0.05)．ConclusionsAquaporins-4 may play important roles in the pathogenesis of pancreatic encephalopathy.

Pancreatitis,acute necrotizing; Pancreatic encephalopathy； Aquaporins-4

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.05.015

200072 上海，同濟大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院 上海第十人民醫(yī)院 消化內(nèi)科(趙嚴、胡國勇、郭傳勇、王興鵬)；山西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科(秦海麗)

王興鵬，Email:wangxp1965@yahoo.com.cn