維藥沒食子對牙釉質脫礦與再礦化作用的掃描電鏡觀察*

李新尚 馮錦虹 林 靜 趙 今

沒食子作為維吾爾藥防齲特色和代表藥物之一，有其獨特的療效，在新疆民間被百姓做為預防齲病的常用藥物，以往防齲作用的研究多采用簡單的湯、丸、散和膏等粗糙劑型，而現有的一些研究不夠系統深入，尚未得到認可和廣泛應用。本研究組前期的研究表明沒食子主要化學成分—沒食子鞣質及其有效提取物可以有效抑制變形鏈球菌的生長，抑制齲病的發展，其毒副作用較氟化物輕微，有望成為一種新型防齲藥物[1]。牙齒脫礦的過程是致齲的重要方面，目前其在礦化領域研究尚未見報道，本研究的目的是通過掃描電鏡觀察維藥沒食子對牙釉質表面的礦化作用，探討沒食子在礦化方面防齲的作用機制，為沒食子的臨床應用研究奠定理論和實驗基礎。

1.材料和方法

1.1 實驗材料 沒食子(Aleppo gall)(由新疆哈博維藥廠提供)，熒光光度計(RF-5301pc型，日本島津公司)，控溫磁力攪拌器(85-2型，江蘇金壇市醫療儀器廠)，氟化鈉(天津市達凈化材料精細化工廠，分析純)，疊氮鈉(天津市福晨化學試劑廠，分析純)，氯化鈣(天津市致遠化學試劑有限公司，分析純)，硝酸鈣、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀(天津市盛鑫精細化工有限公司，分析純)，醋酸(天津市永昴精細化工有限公司，分析純)、HEPES(solarbio)，PH調節計(PB-10型，sartorius)，體視顯微鏡(Nikon，日本)，超聲波清洗機(KQ-200KDE型，昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 釉質的預備 選擇新鮮拔除的牛切牙，除去表面有機污染物，分離冠根，冠部超聲清洗，干燥，體視顯微鏡下觀察無齲損、氟斑、裂痕。用硬組織切割機將牙冠切成10mm×10mm×2 mm大小的釉質塊，唇面釉質用拋光機及碳化硅砂紙在流水下依次磨平、拋光。選擇釉質塊120個，超聲清洗，自然干燥，釉質塊表面開窗9mm×9mm大小，其余部位涂布兩層抗酸指甲油。將120個釉質樣本隨機分為脫礦實驗組和再礦化實驗組，每組各60例。脫礦液及再礦化液具體配置如下，脫礦液：2.2mmol/LCa(NO3)2，2.2mmol/LKH2PO4、50mmol/L醋酸，1.0mmol/L NaN3，0.1mg/L NaF，用5mol/L的KOH調至pH為4.5。再礦化 液 :1.5mmol/L CaCl2，0.9mmol/L KH2PO4，130mmol/L KCl，1mmol/L NaN3，20mmol/L HEPES，pH=7.0。

1.3 脫礦實驗 將預備好的60例釉質標本用嵌體蠟固定在自制的環形玻棒上，放入盛有脫礦溶液的玻璃器皿中，設置釉質表面與溶液的比20mm2/10ml，磁攪拌儀攪拌(100r/min)，60個釉質樣本，隨機分為3組(20個/組)，設為氟化鈉組(陽性對照)、沒食子組、去離子水組(陰性對照)，將各組標本放入脫礦液中，加入各組干預藥物，觀察各組藥物對脫礦過程的影響作用。通過MIC實驗，設置沒食子和去離子水濃度為4mol/L，氟化鈉濃度1mol/L，37℃脫礦作用3d。脫礦前后均選取樣本做掃描電鏡觀察，分析藥物作用效果的差異。

1.4 再礦化實驗 首先將，牛牙樣本制備為人工齲標本，具體方法為將預備好的60例釉質標本用嵌體蠟固定在自制的環形玻棒上，放入盛有脫礦溶液的玻璃器皿中，釉質表面與溶液的比率為20mm2/10ml，磁攪拌儀攪拌(100r/min)，37℃脫礦3天，形成人工齲樣本。

隨后將人工齲樣本后隨機分為3組(20個/組)，即:氟化鈉組(陽性對照)、沒食子組，去離子水組(陰性對照)。沒食子和去離子水濃度為4mol/L，氟化鈉濃度為 1mol/L，再礦化液用2mol/LNaOH將pH調至7.0.然后各組分別進行pH循環實驗，共循環12d，其每天的具體方案[2]見附表。

附表 再礦化pH循環實驗方案

2.結果

2.1 脫礦組掃描電鏡觀察 由電鏡圖可見，正常牙齒表面較為平整(圖1)，去離子水干預脫礦后，牙齒表面凹凸不平(圖2)，氟化鈉處理后，可見牙齒表面雖有不平但可見細密的顆粒(圖3)。沒食子處理后，表面也可見細密的顆粒(圖4)。電鏡圖示去離子水不具有抑制釉質脫礦的作用，氟化鈉及沒食子能使脫礦釉質表面顆粒再附著，具有抑制脫礦的作用。

2.2 再礦化組掃描電鏡觀察 掃描電鏡結果顯示，正常釉質表面較為平坦(圖5)。經脫礦后形成人工齲模型可見表面大小不等的凹坑(圖6)。在人工齲的基礎上，經氟化鈉干預的再礦化循環后，可見細密的顆粒附著，牙齒表面較為平坦(圖7)。經沒食子作用的再礦化循環后，可見顆粒附著，牙面已恢復較為平整，沒食子有著色作用，電鏡片顏色較為發暗(圖8)。經去離子水作用的再礦化循環后，可見牙面較脫礦后圖平整度有所恢復，凹坑變小(圖9)。電鏡圖片顯示氟化鈉及沒食子具有促進再礦化作用，但外觀不如氟化物組那樣規則、均勻(圖 7-8)。

圖1 正常牙釉質表面電鏡圖

圖2 去離子水干預后脫礦釉質表面電鏡圖

圖3 氟化鈉干預脫礦后釉質表面電鏡圖

圖4 沒食子干預脫礦后釉質表面電鏡圖

圖5 正常牙釉質表面電鏡圖

圖6 脫礦后牙釉質表面電鏡圖

圖7 氟化鈉作用于PH循環后電鏡圖

圖8 沒食子作用于PH循環后電鏡圖

圖9 去離子水作用于PH循環后電鏡圖

3.討論

齲病已被公認為世界上一種最常見的慢性感染性疾病[3]。世界衛生組織已將其列為僅次于心血管疾病和腫瘤，位居危害人類的第三位疾病。如何尋找有效地、毒副作用輕微的防齲藥物，逐漸成為研究的熱點。沒食子屬于新疆本土天然藥物，取材方便、價格低廉，前期研究證實其對變形鏈球菌有抑制作用[4]。實驗從該藥礦化領域角度進行研究，如果明確藥物療效，將會推動沒食子走向臨床，造福于廣大的齲病患者。本實驗采用新鮮的離體牛牙作為人牙的替代者，因為牛牙易獲取、其結構與理化性質與人牙非常接近，用它代替人牙已經成為國內外學者廣為接受的選擇[5]。實驗前期研究發現沒食子對致齲密切的變形鏈球菌具有一定的抑制作用[6]，本實驗采用體外脫礦及再礦化化學模型—pH循環，模擬了受致齲因素作用，釉質周圍pH值迅速下降，隨后在唾液緩沖系統中緩慢回升的過程[7]。較為真實的再現了口內環境。

牙齒每天都在進行脫礦和再礦化的過程，保持一個動態平衡。平衡一旦打破，將會導致牙體硬組織脫礦的加重或減輕[8]。脫礦是由于菌斑下的致齲菌在代謝過程中產酸，造成局部微環境的pH值下降，導致硬組織脫礦，羥磷灰石晶體溶解破壞，無機鈣、磷移出所致[9]。再礦化是鈣、磷和其它礦物離子沉積于正常或部分脫礦的牙釉質內或釉質表面的過程。在此過程中，如果脫礦占主導作用，將會導致牙體硬組織缺損。反之，如果再礦化占主導作用，牙體硬組織處于一個被修復的過程。藥物只要對脫礦過程有抑制或對再礦化過程有促進作用，那么這個藥物就對牙體礦化方面有積極作用，進而抑制齲病的發生發展。實驗采用掃描電鏡觀察結果證實在脫礦試驗中，相同的脫礦條件下，氟化鈉及沒食子作用后牙表面可見明顯的顆粒附著，去離子水未見，說明源于氟化鈉及沒食子具有抑制釉質脫礦的作用。再礦化實驗中，氟化鈉、沒食子、去離子水作用后，牙體表面平整度都有不同程度的恢復。去離子水作為陰性對照，本身不具有再礦化的作用，牙體表面較脫礦后有所恢復，說明是單純再礦化液的作用，沒食子及氟化鈉明顯優于去離子水，沒食子顆粒沉積的平整度較氟化鈉略差一點，兩者圖片非常接近。兩實驗結果一致，說明沒食子對釉質礦化效果較氟化鈉接近，是氟化鈉良好的替代藥物。

目前關于藥物防齲現有研究，其抑齲的機制均不甚明了。通過掃描電鏡觀察維藥沒食子，從形態學角度證實了其在礦化方面的積極作用。但其產生、發展的機制仍不清楚，通過實驗觀察，其再礦化及脫礦抑制主要發生在表層和表層下,故推測沒食子礦化的作用機制可能是鞣酸與溶液中的鈣離子發生反應形成絡合物,通過釉質表面微孔道滲透進齲損內部,促進鈣離子沉積,從而引導部分溶解晶體增長促進了再礦化及抑制脫礦，尚需進一步實驗加以證實。

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[5]楚金普，郝玉慶，李繼遙，等.兩種脫礦體系制備人工齲損的病理學比較[J].中國比較醫學雜志，2008，18(1)：23-26

[6]趙 今，牛巧麗，李 艷，等.沒食子及提取物對主要致齲細菌生長的實驗研究[J].科技導報，2009，27(7)：24-28

[7]聶 琳，李 雪，胡德渝.臭氧對脫礦釉質再礦化的實驗研究[J].中華口腔醫學雜志，2007，42(2)：102-105

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[9]馮 巖，尹 偉，胡德渝.定量光導熒光技術評價光滑面早期齲損再礦化時間的臨床研究[J].實用口腔醫學雜志,2008,24(4):563-566