應(yīng)用電化學(xué)測菌法監(jiān)測粘接性牙周夾板對牙周炎患者齦溝液中細(xì)菌定植的影響*

裴振華 施生根 牛忠英 湯楚華 史 亮

牙周炎是菌斑微生物引起的牙周支持組織的慢性感染性疾病，全國口腔健康流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示我國中老年人牙周健康率僅為14%，在嚴(yán)重危害口腔健康的同時(shí)，還可成為中老年人常見全身性疾病如心血管疾病、糖尿病等的重要危險(xiǎn)因素，因此中老年人口腔保健的重要性日顯突出[1-3]。牙齒松動是牙周炎的主要臨床表現(xiàn)之一，松動牙的診治是牙周、修復(fù)治療的難點(diǎn)。牙周夾板在固定松動牙、維護(hù)牙列完整、改善患者咀嚼功能、保持牙周疾病的治療效果和控制其發(fā)展等方面發(fā)揮著重要作用[4-6]，但牙周夾板對牙周微生態(tài)是否會產(chǎn)生不良影響仍知之甚少。

針對目前檢測牙周細(xì)菌的細(xì)菌培養(yǎng)法和PCR檢測技術(shù)存在需厭氧操作、耗時(shí)長等缺陷[7-9]，本研究旨在利用電化學(xué)測量手段的獨(dú)特優(yōu)勢如檢測迅速、測試范圍廣能夠在混濁溶液中進(jìn)行測試等[10,11]，應(yīng)用本課題組前期建立的基于液體電極微流芯片的電化學(xué)測菌法，檢測粘接性牙周夾板固定患者初診時(shí)最深牙周袋位點(diǎn)和健康對照下頜第一磨牙近頰位點(diǎn)，及牙周基礎(chǔ)治療后夾板固定前、固定后2周、固定后4周相應(yīng)位點(diǎn)齦溝液中的牙周致病菌牙齦卟啉單胞菌和有益菌血鏈球菌，并以細(xì)菌培養(yǎng)和定量PCR檢測結(jié)果作為對照，同時(shí)記錄相應(yīng)階段的牙周臨床指標(biāo)包括菌斑指數(shù)、牙齦出血指數(shù)、探診深度和臨床附著水平的變化，旨在觀察粘接性牙周夾板對固定患牙牙周致病菌牙齦卟啉單胞菌和有益菌血鏈球菌定植的影響，同時(shí)進(jìn)一步評估電化學(xué)測菌法的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1.材料和方法

1.1 試劑和儀器 聚二甲基硅氧烷(polydime thylsilicone,PDMS)單體和固化劑 Sylgard 184(Dow Corning,USA)；SU-82025光刻膠和顯影液(Micro Chem Corp.,USA)；Protein Amicrobeads(50nm in diameter,Miltenyi Biotec,Germany)、P.gingivalis ATCC33277 gingipain K抗血清和血鏈球菌 ATCC10556抗血清(自備)；去離子水(Milli-Q SP system,USA)；KCl等生化試劑來自北京大學(xué)化學(xué)院。國產(chǎn)等離子清洗器(PDC-M),阻抗分析儀(Agilent Technologies Inc,USA)，電動注射泵(Harvard,USA)，AB 7500型熒光定量PCR儀(ABI,USA)

1.2 受試患者及其患牙的納入標(biāo)準(zhǔn) 按Amitage(2000)的診斷標(biāo)準(zhǔn)，選擇2010.6-2011.2于解放軍第306醫(yī)院牙周科就診的慢性牙周炎患者10名，年齡在60-81歲之間；松動牙1-4顆，至少有一顆牙松動Ⅱ-Ⅲ度，牙槽骨吸收超過根長的1/2；松動牙位置：位于下頜前牙區(qū)；要求尖牙和前磨牙松動小于Ⅰ度，牙槽骨吸收不超過根長的1/2；無明顯錯(cuò)牙合畸形和局部刺激因素；無糖尿病、心血管疾病等系統(tǒng)性疾病，婦女無妊娠；愿意接受牙周系統(tǒng)治療暨牙周基礎(chǔ)治療和夾板固定修復(fù)等；患者本人同意參加本研究，并能夠按時(shí)隨訪。

1.3 牙周基礎(chǔ)治療、夾板固定和監(jiān)測時(shí)間 本研究相關(guān)的牙周基礎(chǔ)治療、夾板固定和患牙齦溝液細(xì)菌監(jiān)測均由1名副主任醫(yī)師和1名主治醫(yī)師完成。

夾板類型：采用Super-bond C&B樹脂粘接性夾板(日進(jìn)齒科，日本)。

監(jiān)測時(shí)間共分四個(gè)時(shí)間點(diǎn)即初診(T0)、牙周基礎(chǔ)治療后夾板固定前(T1)、固定后2周(T2)、固定后 4 周(T3)。

1.4 齦溝液采集[12]采集位點(diǎn)：患牙為最深牙周袋位點(diǎn)(2-3個(gè)位點(diǎn))共22個(gè)位點(diǎn)取樣，健康對照牙均為下頜健康第一磨牙的近頰位點(diǎn)共10個(gè)位點(diǎn)；取樣部位隔濕、吹干，去除齦上菌斑，將Whatman3MM濾紙條輕輕插入袋內(nèi)，至有輕微阻力為止。留置30s后取出，即刻放入盛有生理鹽水的Eppendorf管中。每個(gè)位點(diǎn)間隔20min重復(fù)取樣一次。

1.5 牙周臨床指標(biāo)記錄 依據(jù)國際公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)記錄菌斑指數(shù)、牙齦出血指數(shù)、探診深度和臨床附著水平。

1.6 電化學(xué)測菌法量化齦溝液中的牙齦卟啉單胞菌和血鏈球菌

(1)齦溝液中牙齦卟啉單胞菌和血鏈球菌的免疫磁分離 Protein Amicrobeads(50nmin diameter,Miltenyi Biotec,Germany)、P.gingivalis ATCC 33277 gingipain K抗血清、血鏈球菌ATCC1055抗血清用于P.gingivalis的磁分離。具體步驟按照磁珠應(yīng)用說明書進(jìn)行，最后將Protein A納米磁珠-抗體-細(xì)菌復(fù)合物在去離子水中室溫平衡20min待測。

(2)細(xì)菌的電阻抗測量 芯片制作和電阻抗測量設(shè)備和方法、阻抗-細(xì)菌濃度線性關(guān)系式擬合方法同前期研究[11,13]。根據(jù)阻抗-細(xì)菌濃度線性關(guān)系式，通過檢測樣本的電阻抗值推算出樣本中牙齦卟啉單胞菌和血鏈球菌的初始濃度。牙齦卟啉單胞菌為系統(tǒng)相對阻抗變化NIC=-10.33 logC(cells/ml)+58.72，R2=0.96(檢測下限為 106cells/ml)，血鏈球菌為NIC=-8.12 logC(cells/ml)+8.49，R2=0.98(檢測下限為104cells/ml)。

1.7 細(xì)菌培養(yǎng) 將齦溝液樣本進(jìn)行1∶10倍比稀釋至 10-2、10-3、10－4、10-5后，各取 100μl原液和稀釋液均勻涂布接種牙齦卟啉單胞菌選擇性培養(yǎng)基和血鏈球菌選擇性培養(yǎng)基。37℃厭氧培養(yǎng)，牙齦卟啉單胞菌培養(yǎng)4天，血鏈球菌培養(yǎng)2天。通過計(jì)數(shù)接種平板上菌落的平均值計(jì)算出細(xì)菌數(shù)量。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測 細(xì)菌模板DNA的提取依據(jù)細(xì)菌DNA提取試劑盒(Omega,USA)的操作說明進(jìn)行。

牙齦卟啉單胞菌16s RNA的PCR擴(kuò)增引物為：上游引物5’TGGTAGTCCACGCAGTAAA-3’，下游引物 5’-TGTCCCTCCCAATGT AAC-3’，片段大小為452bp；實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增引物為5’-ACCTTACCCGGGATTGAAATG-3’，下游引物 5’-CAACCATGCAGCACCT ACATAGAA-3’，片段大小為83bp。

血鏈球菌16s RNA的PCR擴(kuò)增引物為：上游引物 5’-ATTGTTAGTTGCCATCA-3’，下游引物5’-TACCTTGTTACGACTTCACCC-3’,片段大小為390bp；實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增引物為5’-CCAGTCTCAGTTCGGATTGTAGGCT-3’，下游引物 5’-ACTCTCGTGGTGTGACGGGCGG TGT-3’，片段大小為130bp。

細(xì)菌實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：2μlDNA模板，引物各0.4μl，1.6μl dNTPs(2.5mM)，10μl REALSYBRMixture(2×)，7.2μl去離子水。PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)：95°10min，(95℃ 15sec，60℃ 60sec)×40個(gè)循環(huán)。

1.9 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析 分別應(yīng)用OriginLab 8.0軟件和利用SPSS13.5軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2.結(jié)果

2.1 粘接性夾板固定對P.gingivalis和S.sanguinis定植的影響 電化學(xué)測菌法、細(xì)菌培養(yǎng)和實(shí)時(shí)定量PCR三種方法檢測粘接性牙周夾板患牙和健康對照牙相應(yīng)位點(diǎn)齦溝液中牙齦卟啉單胞菌和血鏈球菌的結(jié)果，如附表所示。應(yīng)用電化學(xué)測菌法檢測，初診樣本中兩種菌的檢出率達(dá)100%，牙周基礎(chǔ)治療后相應(yīng)位點(diǎn)中兩種菌的數(shù)量均在檢測下限以下；電化學(xué)測菌法獲得的細(xì)菌數(shù)量顯著少于實(shí)時(shí)定量PCR(P=0.00)，與細(xì)菌培養(yǎng)相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.43)。電化學(xué)測菌法的檢測結(jié)果與細(xì)菌培養(yǎng)、定量PCR檢測結(jié)果之間呈正相關(guān)關(guān)系(P=0.00)。

在患牙檢測位點(diǎn)，牙周基礎(chǔ)治療后牙齦卟啉單胞菌的數(shù)量較初診時(shí)顯著減少，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00)。夾板固定期間(T2、T3)牙齦卟啉單胞菌的數(shù)量均低于檢測下限106cells/ml，且與固定前T1相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.00)；在健康牙位點(diǎn)，牙齦卟啉單胞菌的數(shù)量改變趨勢同患牙檢測位點(diǎn)，如圖1所示。

在患牙檢測位點(diǎn)，牙周基礎(chǔ)治療后血鏈球菌的數(shù)量較初診時(shí)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.02)。夾板固定期間(T2、T3)血鏈球菌的數(shù)量與固定前T1相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.98)；在健康牙位點(diǎn)，牙周基礎(chǔ)治療后血鏈球菌的數(shù)量較初診時(shí)減少(P=0.00)，與固定前T1相比，夾板固定后2周T2血鏈球菌的數(shù)量即增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.55)，夾板固定后4周T3血鏈球菌的數(shù)量顯著增加(P=0.00)如圖2所示。

細(xì)菌培養(yǎng)和定量PCR檢測結(jié)果顯示血鏈球菌/牙齦卟啉單胞菌的比值在T0、T1、T2、T3期總體上呈逐漸上升的趨勢，如圖3、圖4所示。

2.2 粘接性夾板固定對牙周臨床指標(biāo)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示牙周系統(tǒng)治療后炎癥部位的菌斑指數(shù)(圖5)，牙齦指數(shù)(圖6)，探診深度(圖7)和臨床附著水平(圖8)均有明顯改善。夾板固定期間(T2、T3)雖然個(gè)別部位的菌斑指數(shù)和齦出血指數(shù)較夾板固定前T1升高，但與初診相比，仍有明顯改善。

3.討論

老年人牙周病發(fā)病率高，防治重點(diǎn)除定期的牙周基礎(chǔ)治療外,可結(jié)合各類夾板和各種固定方式保證松牙的穩(wěn)定,有利牙齒的保留,延長使用壽命，改善咀嚼和消化吸收功能，從而對提高老年人的生活質(zhì)量，保證老年人的身心健康，減輕社會醫(yī)療負(fù)擔(dān)有重要作用。但是夾板修復(fù)體在控制炎癥的同時(shí)可從多個(gè)方面影響到牙周的微環(huán)境：①妨礙口腔清潔的修復(fù)體易則造成菌斑滯留，②某些修復(fù)材料的表面較自然牙更易于菌斑聚集和微生物的生長，③牙周膜內(nèi)細(xì)胞的分泌及其代謝產(chǎn)物受修復(fù)體咬合暨牙周組織應(yīng)力的調(diào)控。而牙周微環(huán)境可以對局部牙周微生物的種類和數(shù)量產(chǎn)生廣泛的影響[14]。據(jù)報(bào)道，圓錐型套筒冠義齒夾板戴入后齦下菌斑中牙周致病菌數(shù)量增加，但與非固定組比，患牙牙周炎臨床指標(biāo)的控制較好[15,16]。本實(shí)驗(yàn)利用電化學(xué)測菌法檢測夾板固定不同時(shí)間炎癥和健康位點(diǎn)齦溝液中的牙齦卟啉單胞菌和血鏈球菌，結(jié)果顯示牙周基礎(chǔ)治療后以及在整個(gè)夾板固定后的觀察期間，牙齦卟啉單胞菌和血鏈球菌細(xì)菌數(shù)量顯著下降,牙齦卟啉單胞菌的數(shù)量基本均在檢測下限以下。由于受檢測下限所限，部分阻抗數(shù)據(jù)不能獲得，所以不能記錄通過電化學(xué)測菌法獲得的兩種菌的比值變化。但是細(xì)菌培養(yǎng)和定量PCR的檢測結(jié)果在進(jìn)一步驗(yàn)證了電化學(xué)測菌法的檢測結(jié)果基礎(chǔ)上，結(jié)果顯示有益菌血鏈球菌與致病菌牙齦卟啉單胞菌的比值呈上升的趨勢，從而在一定程度上表明該粘結(jié)性牙周夾板短期內(nèi)不會對夾板固定患牙牙周微環(huán)境中致病菌牙齦卟啉單胞菌和有益菌血鏈球菌的定植產(chǎn)生不良影響。

附表 粘接性牙周夾板患者不同時(shí)期齦溝液中牙齦卟啉單胞菌和血鏈球菌的數(shù)量(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)

圖1 P.gingivlis的電化學(xué)測菌法檢測結(jié)果

圖2 S.sanguinis的電化學(xué)測菌法檢測結(jié)果

圖3 血鏈球菌/牙齦卟啉單胞菌的比值(細(xì)菌培養(yǎng)法)

圖4 血鏈球菌/牙齦卟啉單胞菌的比值(實(shí)時(shí)定量PCR法)

圖5 粘接性夾板固定患牙炎癥位點(diǎn)不同觀察期的菌斑指數(shù)變化

圖6 粘接性夾板固定患牙炎癥位點(diǎn)不同觀察期的牙齦指數(shù)變化

圖7 粘接性夾板固定患牙炎癥位點(diǎn)不同觀察期的探診深度變化

圖8 粘接性夾板固定患牙炎癥位點(diǎn)不同觀察期的臨床附著水平變化

傳統(tǒng)用于牙周細(xì)菌定量檢測的方法主要是細(xì)菌培養(yǎng)和定量PCR，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用本課題組前期建立的電化學(xué)測菌法檢測牙齦卟啉單胞菌和血鏈球菌，主要是針對傳統(tǒng)方法檢測條件苛刻、檢測周期長、檢測成本高等缺陷，充分利用電化學(xué)測菌法呈現(xiàn)出的樣本處理較簡單、檢測迅速、檢測成本低等優(yōu)勢，結(jié)果顯示與細(xì)菌培養(yǎng)和定量PCR量化結(jié)果比較，盡管牙周基礎(chǔ)治療后，由于細(xì)菌數(shù)量低于檢測限，電化學(xué)測菌法不能獲得細(xì)菌的準(zhǔn)確數(shù)量，但總體樣本檢測結(jié)果分析，電化學(xué)測菌法的量化結(jié)果與細(xì)菌培養(yǎng)、定量PCR量化結(jié)果之間仍是正相關(guān)關(guān)系；且在檢測細(xì)菌數(shù)量相對多的初診齦溝液樣本時(shí)，電化學(xué)測菌法的量化結(jié)果與細(xì)菌培養(yǎng)、定量PCR量化結(jié)果高度正相關(guān)。由此表明當(dāng)牙齦卟啉單胞菌和血鏈球菌數(shù)量在檢測下限以上時(shí)，電化學(xué)測菌法可在一定程度上代替細(xì)菌培養(yǎng)和定量PCR方法用于臨床實(shí)際樣本中細(xì)菌的定量檢測。

本實(shí)驗(yàn)選擇Super-bond C&B樹脂粘接劑制作粘結(jié)性牙周夾板,是緊密結(jié)合了老年人口腔治療的特殊性,例如老年人多不能一次耐受長時(shí)間的口內(nèi)操作,全身因素導(dǎo)致的行動便利性下降，多數(shù)不接受過多的牙齒預(yù)備，由于不需做牙體預(yù)備，固定強(qiáng)度強(qiáng)，操作簡便，操作時(shí)間短，減少了老年患者的不適感。另一方面粘接劑凝固前流動性好，制作時(shí)不易造成松動牙的病理性移位,易塑形，形成良好鄰間隙，有利于自潔。由于病例資料的相繼流失,本實(shí)驗(yàn)沒能夠獲得所有病例的較長期完整觀察結(jié)果,但是本實(shí)驗(yàn)現(xiàn)階段結(jié)果顯示炎癥部位的菌斑指數(shù)，齦出血指數(shù)，牙周探診深度和臨床附著水平均有明顯改善。夾板固定期間雖然個(gè)別部位的菌斑指數(shù)和齦出血指數(shù)較夾板固定前升高，但與初診相比，仍有明顯改善。

綜上所述，利用牙周夾板進(jìn)行老年牙周炎患者的松動牙固定，對改善口腔和促進(jìn)全身健康具有重要意義，粘結(jié)性牙周夾板短期內(nèi)不會對老年患者牙周微環(huán)境中的致病菌牙齦卟啉單胞菌和有益菌血鏈球菌的定植產(chǎn)生不良影響，且操作時(shí)間和夾板固定效果患者接受度好，但有關(guān)牙周夾板對固定患牙牙周微生態(tài)影響的長期效應(yīng)還有待進(jìn)一步觀察研究。

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