鯉魚腦垂體和HCG誘導雌性河鰻性腺成熟過程中鈣磷變化的初步研究

高曉陽，劉利平，蔣天寶，陳文銀，吳嘉敏

(上海海洋大學省部共建水產種質資源發掘與利用教育部重點實驗室，中國 上海 201306)

河鰻學名為日本鰻鱺，是一種經濟價值很高的生殖洄游性魚類，素有“水中人參”之稱．仔鰻在淡水中生長發育3～5年后，在秋冬季成群地游向大海開始生殖洄游．河鰻進入海水后，性腺逐漸發育成熟，在海洋中產卵．在生殖洄游整個過程中，河鰻不攝食[1-2]，其物質和能量來源主要由身體的儲存供給[3]．20世紀80年代以來，世界養鰻業迅速發展，尤其是在我國，河鰻已成為水產養殖中產業化程度最高的品種之一．然而，由于養殖所需的苗種完全依靠天然捕撈，掠奪式的捕撈方式致使鰻苗資源逐年下降．河鰻苗種短缺限制了鰻鱺養殖業的進一步發展，開展河鰻人工繁殖技術研究勢在必行．國內一般通過注射外源激素如腦垂體和HCG等促使河鰻親魚性腺發育成熟、產卵，但親魚的產卵率和卵子受精率都很低．卵子發育需動用身體儲存的營養物質而關于成熟過程中生化指標的變化少見報道．本文模擬自然條件實驗過程中不投喂餌料，從注射鯉魚腦垂體和HCG(人絨毛膜促性腺激素)的雌性河鰻鈣、磷指標的變化入手，探討其轉移轉化規律，為河鰻親魚強化培育和人工繁殖的突破提供基礎性參考資料．

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用63尾親魚均購自上海市惠南鎮天英河水產經營部池塘養殖鰻鱺，選擇體質健壯，無病害的鰻鱺為實驗用魚．雌鰻體重為845～1 020 g．所有親魚運回實驗室的養殖室海水玻璃循環系統中進行養殖．經15 d逐步適應海水后，隨機分4組養殖于鹽度為28的海水中，試驗期間水溫為16～25 ℃．

1.2 實驗設計

本實驗共分4組．第1組恒量注射腦垂體和HCG；第2組梯度注射腦垂體和HCG(腦垂體和HCG均溶解在7 g/L生理鹽水中)，第1組和第2組最后注射激素劑量相同；第3組注射等量的7 g/L生理鹽水；第4組不做任何處理只養殖在海水循環系統中．每周注射1次，注射方式為背部肌肉注射，注射劑量如下表所示.

表1 實驗分組和激素注射方法

1.3 樣品采集及分析

每兩周采一次樣品，每組3尾魚，邊注射邊取樣．在注射第1針分組前先隨意挑選3尾雌性親魚，用MS-222完全麻醉魚體，解剖魚體計算性腺成熟系數(GSI)和肝體系數(HSI)； 采集性腺、肝臟、肌肉、骨骼，存放于-20 ℃冰箱，測定前把樣品放入冷凍干燥機完全干燥樣品，測定干燥樣品鈣、磷含量,測定方法參考林鼎等[4]方法進行測定；用5 mL一次性無菌注射器動脈采血，取完血后，將血液注入肝素鈉抗凝血的玻璃采血管中4 ℃冰箱放置2～4 h，待血液凝固析出血清后，將血樣4 ℃下4 000 r/min離心15 min,取血清用于血液鈣、磷等成分分析．用全自動血液生化分析儀(邁瑞BS-200)分析血清中鈣、磷含量．

1.4 數據處理

實驗結果采用spss(Version 11.5)統計軟件進行處理分析，利用單因素方差分析(Oneway ANOVA)來檢驗各實驗組生化指標間的顯著性，用Duncan’s進行多重比較檢驗．

2 結果與分析

2.1 注射腦垂體和HCG對性腺成熟系數的影響

經過70 d的發育過程，恒量組和梯度組雌性河鰻的性腺成熟系數達到(25.2±4.35)%和(24.8±4.72)%，而對照組和空白組僅為(2.42±0.18)%和(1.93±0.13)%，對照組性腺成熟系數增幅比空白組稍大，但是沒有明顯的差異(P﹥0.05)；空白組性腺有一定程度的發育，但是不明顯(圖1)．

2.2 注射腦垂體和HCG對組織中鈣含量變化的影響

通過10次注射腦垂體和HCG，恒量組和梯度組的雌魚骨骼中鈣的含量明顯下降．注射激素前骨骼鈣干質量分數為(1.017 7±0.049 4)%，而恒量組和梯度組在第70 d骨骼鈣質量分數達到(0.746 3±0.090 4)%和(0.747 7±0.116 6)%，與對照組和空白組有顯著性差異(P﹤0.05)(圖2)．

圖1 注射腦垂體和HCG對雌性河鰻GSI的影響

圖2 注射腦垂體和HCG對雌性河鰻骨骼鈣含量的影響

血清中鈣含量表現出一定的規律性變化，首先恒量組和梯度組血清中鈣含量迅速下降，在第14 d達到最小值，分別是(0.55±0.17)mmol/L和(0.534±0.11)mmol/L；然后開始上升，到性腺發育到第ⅴ期，其含量達到了最大值，分別達到(1.193±0.2)mmol/L和(1.187±0.22)mmol/L；對照組和空白組表現為不同程度的下降(圖3)．

恒量組和梯度組雌魚的性腺中鈣的含量明顯增加，注射激素前雌魚性腺鈣的干質量分數為(7.3±2.92)%，而在第70 d達到了(51.4±17)%和(49.6±20.3)%．對照組和空白組與注射前沒有明顯差異 (圖4)；處理組肝臟中鈣的質量分數明顯上升，第70 d分別達到(35.2±5.41)%和(34.9±6.8)%；而空白組和對照組和注射前沒有明顯差別(圖5).肌肉中鈣含量基本無變化．

圖3 注射腦垂體和HCG對雌性河鰻血清中鈣含量的影響

圖4 注射腦垂體和HCG對雌性河鰻性腺鈣含量的影響

2.3 注射腦垂體和HCG對組織中磷含量的影響

通過10次注射腦垂體和HCG后，恒量組和梯度組骨骼中的磷質量分數在第70 d分別顯著下降到(0.97±0.4)×10-5和(0.99±0.47)×10-5，而對照組和空白組含量變化不明顯(P﹥0.05)(圖6)；血清中磷含量也表現為一定規律的變化，首先實驗組磷含量迅速下降，到28 d達到最小值，分別是(1.494±0.85)mmol/L和(1.168±0.73)mmol/L，然后開始上升，到70 d的時候達到(2.196±0.91)mmol/L和(2.188±1.02)mmol/L；而對照組血清中磷下降明顯，空白組變化不明顯(圖7)．注射激素的兩組雌魚中性腺的磷質量分數明顯增加，到第70 d時，處理組分別達到(0.213 3±0.073 3)%和(0.212 2±0.083 7)%，而對照組和空白組變化不顯著(圖8)；而肝臟和肌肉中磷質量分數為(0.21～0.25)×10-5，在整個實驗過程中4個組之間無顯著性差異(P>0.05)．

圖5 注射腦垂體和HCG對雌性河鰻肝臟鈣含量的影響

圖6 注射腦垂體和HCG對骨骼中磷含量的影響

圖7 注射腦垂體和HCG對血清中磷含量的影響

圖8 注射腦垂體和HCG對性腺中磷含量的影響

3 討論

雌魚在卵巢發育過程中，肝臟在17β-E2誘導下合成和釋放雌性特有的卵黃蛋白原．這些卵黃蛋白原經過血液運輸，在促性腺激素作用下進入發育的卵母細胞在卵母細胞內積累，形成卵黃顆粒，從而促使卵母細胞逐漸成熟，GSI逐漸增加[5]．卵黃蛋白原是雌魚特有的蛋白質，是一種鈣結合脂磷蛋白．DOROSHOV等發現高首鱘在性腺發育過程中卵黃蛋白原的發生過程伴隨著Ca2+和P濃度的變化[6]；LINARES-CASENAVE等也發現了高首鱘在性腺發育過程中Ca2+和卵黃蛋白原的線性關系[7]；李朝軍等對大阪鯽的研究表明Ca2+能夠促進卵母細胞的發育和蛋白的吸收[8]，可見鈣在魚類卵細胞發育過程中起到了相當重要的作用；在本實驗中HIS也顯著升高，說明肝臟中卵黃蛋白原的合成和釋放增加，以及卵巢中卵黃積累的增加．

有意思的是，本實驗中，河鰻性腺發育過程中，肝臟和卵巢中鈣含量逐漸升高，這些鈣和磷到底是來源在哪？由于整個實驗過程中雌鰻沒有進食任何食物，因此除可能通過鰓從海水中攝取外，體內各器官之間可能有鈣磷發生轉移，以滿足卵巢發育．在注射腦垂體和HCG后骨骼中的鈣含量降低，而性腺和肝臟中鈣含量增加，表明腦垂體和HCG誘導雌性河鰻動員了骨骼中的鈣轉移到性腺和肝臟中,參與了性腺的發育． 17β-E2可以促使鈣從骨骼中調動出來[9]，從有些魚類中發現骨骼中存在17β-E2受體，17β-E2可能通過影響其受體來影響鈣和礦物質的含量[10]．

鈣參與魚類多種生理活動，如參與肌肉收縮、血液凝固、神經傳遞、滲透壓調節和多種酶反應等過程，也與保持生物膜的完整性有關．魚體缺鈣時生長緩慢，食物轉換率低，死亡率高． 魚體的鈣99%以上存在于骨骼內，血鈣全部存在于血清中，細胞中只有極微量的鈣質[11]．魚類血液生化指標雖然受諸多因素的影響，但仍然能夠反應該魚類健康狀況和生理狀況[12],性別和性成熟是影響魚類血液生化指標的重要因素[13]．葉勤等已經證實血清游離Ca2+在魚類生殖期生理活動中起重要作用[14]．因此測定血清和組織中鈣的含量有助于了解鈣與雌鰻性腺發育的相互關系，為河鰻的人工繁殖積累基本的理論依據．本實驗測得雌魚性腺發育到第Ⅱ期后，鈣含量出現波動下降，從第Ⅲ期、第Ⅳ和第Ⅴ期鈣含量明顯上升；這與葉勤等測定嘉陵江瓦氏黃顙魚雌魚血清鈣含量隨卵巢發育逐漸上升[14]這一結果比較相似．葉勤等[14]和張濤等[15]還發現,卵巢發育后期血清中鈣含量逐漸下降，這些結果與作者得到的結論有不同之處，有待進一步研究．SUBHEDAR等認為在誘導性成熟過程中，斯氏小囊的活動對于從血庫中調動鈣的儲存并輸送到正在發育成熟的性腺中可能起重要作用[16]，這與作者研究性腺發育整個過程調動血清中鈣類似，本實驗證實腦垂體和HCG誘導雌性河鰻發育初期血清中鈣含量也有迅速下降的趨勢，有可能就是斯氏小囊調動了血庫中的鈣，再次證明鈣在魚類生殖生理活動中起著重要作用．

磷在糖和脂肪的代謝中起重要作用，還參與能量轉化，維持細胞的通透性，遺傳密碼和生殖活動的調控．魚體缺磷則使骨骼發育不正常，特別是頭部畸形，血細胞含量減少，生長緩慢以及食物轉換率低．在鯉魚中曾經發現，生長率與食物中磷的含量呈正相關關系．因為磷在水中含量很少，食物是魚類磷的主要來源,而本實驗整個過程中河鰻不進食任何食物，但是隨著性腺的發育性腺中磷含量逐漸增加，血液中磷含量經歷短暫的下降后也逐漸上升，骨骼中磷含量顯著減少．說明整個過程調動了骨骼中的磷通過血液轉移到了性腺供性腺的發育．魚類血液生化指標能反應魚類的物種特征及其生理狀態，還能為繁殖等提供重要參考依據[17]．張濤等也證實了雌性鱘魚血漿中無機磷含量隨著性腺發育顯著升高[15]，李云等[18]和王友惠等[19]在對瓦氏黃顙魚(Pelteobagrusvachelli)的研究中發現,隨著雌魚性腺的發育，血清中磷濃度逐漸升高，到Ⅳ期末達到最大值；這和本實驗結果類似．本實驗注射激素前期血清中磷含量經歷了短暫的下降，原因可能是魚不同，其變化規律稍有不同．據相關文獻報道除了鈣、磷以外還有其他生化指標也有一定的變化如蛋白、脂肪、灰分等．肖亞梅等[20]發現黃鱔不同時期性腺發育蛋白差異和張利紅等[4]發現鰻鱺不同發育時期脂肪差異．變化機理有待進一步研究．

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