X染色體連鎖凋亡抑制蛋白的表達、純化及多抗血清的制備①

馬瑞娟 孫敏英 楊學習 徐偉文 (南方醫(yī)科大學生物技術學院，廣州510515)

凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apoptosis protein，IAPs)是一類在結構上具有同源性的細胞內源性凋亡抑制蛋白家族。人類IAPs的主要成員有X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)、cIAP1、cIAP2、生存素 survivin、livin、神經元凋亡抑制蛋白NIAP等[1]。X-染色體連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)是凋亡抑制蛋白家族中的重要成員，是Liston等于1996年運用DNA印跡和聚合酶鏈反應(PCR)技術在人胚胎腦組織中克隆出的，其基因位于X染色體q24-25，含有497個氨基酸，分子質量為54 kD的蛋白質，其蛋白氨基端由3個BIR區(qū)域和羧基端1個環(huán)狀鋅指結構組成[2]。XIAP可以通過直接與 caspase-9、caspase-3、caspase-7結合來抑制caspase活性，從而抑制細胞凋亡的發(fā)生[3]。研究發(fā)現XIAP表達于大多數的腫瘤組織，而在正常組織中不表達，與腫瘤的進展、復發(fā)、預后以及腫瘤化療的耐藥性密切相關，可能是腫瘤診治的新靶點[4-7]。本研究構建XIAP原核表達載體，在大腸桿菌中表達了XIAP重組蛋白并通過親和層析純化得到高質量的重組蛋白，免疫BALB/c小鼠，獲得高效價多抗血清，希望能為人X染色體連鎖凋亡抑制蛋白結構和功能的研究及診斷試劑的研制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 原核表達載體pET30a(+)、大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)由本實驗室保存;人XIAP重組載體pET30a(+)/XIAP由本實驗構建;IPTG、考馬斯亮藍 R250和Kan購于Sigma公司;Ni-Separose填料購于GE公司;其他試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 重組質粒在大腸桿菌中的誘導表達pET30a(+)和 pET30a(+)/XIAP轉化的 BL21(DE3)單克隆于LB(Kan+)液體培養(yǎng)基中37℃，200 r/min過夜培養(yǎng);次日以1∶200的比例轉接于新的LB(Kan+)培養(yǎng)基中，于37℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600達到0.6時，加入IPTG至終濃度1 mmol/L繼續(xù)培養(yǎng)4小時，同時設未誘導對照，離心收集菌體，取樣用上樣緩沖液懸浮沉淀后100℃煮沸5分鐘，離心后取上清進行SDS-PAGE蛋白電泳，考馬斯亮藍R250染色后觀察結果。

1.2.2 重組質粒在大腸桿菌中的大量表達 接種pET30a(+)/XIAP轉化BL21(DE3)單克隆于含有50 ml液體LB(Kan+)培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中于37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。次日將過夜培養(yǎng)物以1∶200的量接種于新的含有600 ml液體 LB(Kan+)培養(yǎng)基的2 L三角瓶中，于37℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600值達到0.6時，加入IPTG至終濃度1 mmol/L繼續(xù)培養(yǎng)4小時。4℃、8 000 r/min離心收集菌體。1 L培養(yǎng)物以25 ml結合緩沖液(具體物質及具體濃度)懸浮，1∶1 000加入 β-巰基乙醇，1∶10加入10 mg/ml的溶菌酶母液。反復凍融3個循環(huán)，冰浴超聲破碎菌體后離心，分別收集上清、沉淀。SDS-PAGE蛋白電泳，考馬斯亮藍R250染色后觀察結果。

1.2.3 包涵體的洗滌 蛋白包涵體表達時，1 L培養(yǎng)物超聲后沉淀加入25 ml含2 mol/L尿素的結合緩沖液懸浮，懸浮后振搖30分鐘，離心，保留上清。沉淀用25 ml含4 mol/L尿素的結合緩沖液懸浮，懸浮后振搖30分鐘，離心，保留上清。沉淀用20 mol含8 mol/L尿素的結合緩沖液懸浮，離心并保留上清和沉淀。每次離心的上清、沉淀進行SDS-PAGE蛋白電泳，考馬斯亮藍R250染色后觀察結果。

1.2.4 重組蛋白的純化及復性 包涵體洗滌后上清用0.22 μm濾膜過濾，Ni-Sepharose親和層析純化重組蛋白。具體步驟如下述，純化柱經5個柱體積的含8 mol/L尿素的Binding buffer平衡后，過濾后樣品上柱，流速為2 ml/min，用含8 mol/L尿素的Binding buffer平衡至基線后再用Elutiong buffer(20 mmol/L NaH2PO4，0.5 mmol/L NaCl，500 mmol/L 咪唑，pH=8.0)洗脫，收集峰值樣品。SDS-PAGE電泳觀察結果。純化后樣品依次在尿素濃度為6、4、2和0 mol/L的PBS溶液透析4小時，去除蛋白溶液中的尿素使蛋白復性，復性后樣品經SDS-PAGE電泳檢測。

1.2.5 重組蛋白的Western blot鑒定 純化后重組蛋白經SDS-PAGE電泳后轉移至PVDF膜上，依次經過5%(W/V)奶粉封閉、TBST洗滌、抗His抗體處理、TBST洗滌、辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗孵育、化學發(fā)光試劑增強反應、X光片曝光和光密度掃描儀采集X光片上的圖像。

1.2.6 抗血清的制備及鑒定 將50 μg抗原與等體積皂土佐劑充分混合，皮下、腹股溝、腹腔多點注射免疫BALB/c小鼠，間隔兩周同樣的方法免疫一次，再間隔兩周腹腔注射加強免疫，一周后采血。分離血清，通過ELISA檢測抗血清的效價。用純化重組蛋白包被96孔板，4℃過夜;37℃封閉2小時，倍比稀釋的小鼠血清37℃孵育1小時。1∶10000稀釋的辣根過氧化物酶標記羊抗鼠二抗37℃孵育45分鐘。TMB顯色，測定450 nm處測A值。

2 結果

2.1 重組表達載體pET30a(+)/XIAP的誘導表達 分別誘導原核表達載體pET30a(+)、重組載體pET30a(+)/XIAP轉化的大腸桿菌BL21(DE3)單克隆菌株。SDS-PAGE電泳結果如圖1所示，pET30a(+)/XIAP轉化菌經IPTG誘導的樣品在分子量54 kD附近出現明顯條帶，pET30a(+)/XIAP轉化菌未誘導的樣品、pET30a(+)轉化菌誘導樣品、pET30a(+)轉化菌未誘導樣品皆沒有相應條帶的出現(圖1)。同重組蛋白的理論值54 kD一致，表明重組蛋白可以誘導表達。

2.2 pET30a(+)/XIAP的大量表達及包涵體的洗滌 收集大量表達pET30a(+)/XIAP的菌體，結合使用溶菌酶、凍融和超聲的方法破碎菌體。菌體破碎后上清和沉淀的SDS-PAGE蛋白電泳結果顯示重組蛋白主要存在于沉淀中，上清中幾乎沒有重組蛋白，即重組蛋白以包涵體形式表達(圖2泳道1、2)。沉淀用含有2 mol/L和4 mol/L尿素的Binding buffer洗滌去除雜蛋白后用含有8 mol/L尿素的Binding buffer溶解。SDS-PAGE電泳檢測表明2 mol/L和4 mol/L尿素的洗滌可以去除部分雜蛋白(圖3泳道1、3)，而大部分重組蛋白仍然存在于沉淀中(圖3泳道2、4)。含有8 mol/L尿素的Binding buffer可以溶解大部分的重組蛋白(圖3泳道5)，但沉淀中仍有少量重組蛋白的存在(圖3泳道6)。

圖1 重組蛋白表達產物SDS-PAGE電泳結果Fig.1 SDS-PAGE analysis for the expression product of pET-30a(+)/XIAP

圖2 超聲破碎后SDS-PAGE電泳結果Fig.2 SDS-PAGE analysis for the lysed

2.3 重組蛋白的純化及復性 過濾后的樣品經Ni-Sepharose親和層析進行重組蛋白的純化。純化的樣品通過梯度透析進行復性。SDS-PAGE電泳分析純度達到90%以上(圖4)。

2.4 重組蛋白的Western blot鑒定 純化后重組蛋白經SDS-PAGE電泳后轉移至 PVDF膜上，依次經過5%(W/V)奶粉封閉、TBST洗滌、抗His抗體處理、TBST洗滌、辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗孵育、化學發(fā)光試劑增強反應、X光片曝光和光密度掃描儀采集X光片上的圖像。在約54 kD的位置出現目的條帶如圖5所示，表明純化的重組蛋白是帶His標簽的目的蛋白。

圖3 重組蛋白包涵體洗滌SDS-PAGE電泳結果Fig.3 SDS-PAGE analysis for the dissolve inclusion bodies of recombinant protein

圖4 重組蛋白SDS-PAGE電泳結果Fig.4 SDS-PAGE analysis for purified protein

表1 ELISA檢測XIAP重組蛋白抗血清的效價結果Tab.1 ELISA for titer of XIAP recombinant protein antiserum

圖5 Western blot鑒定重組蛋白結果Fig.5 Identification by Western blot

2.5 XIAP重組蛋白抗血清的效價的檢測 見表1。

3 討論

XIAP是人類細胞內源性凋亡抑制蛋白家族的成員之一，研究發(fā)現XIAP基因在大多數腫瘤細胞株中過度表達，廣泛表達于多種成年人腫瘤及胚胎組織中，通過與TRAF1和TRAF2結合抑制凋亡，與細胞凋亡調控的紊亂及細胞的惡性轉變具有十分密切的關系，在腫瘤的進展、復發(fā)、預后以及腫瘤化療的耐藥性等事件上均有重要相關性[8-10]。

如Mizutani等[11]的研究表明在90%的腎細胞癌中表達XIAP，其中高表達XIAP的透明細胞腎癌達35% ～50% ，隨著分期和核分級的升高，高表達XIAP的比率也增加。五年的生存分析表明XIAP為腎細胞癌一個獨立不良的預后因素。Tanaka等[12]、張穎超[13]在乳腺癌組織中發(fā)現 XIAP 的陽性率為70.5%以上，而在癌旁正常乳腺組織中無表達，提示XIAP蛋白在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展不同階段呈不同程度的表達，過度表達提示預后不良。Hofmann等[14]運用肺癌的組織標本進行逆轉錄-多聚酶鏈反應和免疫印跡研究XIAP的表達，認為XIAP是促進腫瘤發(fā)生的重要因子。Shiraki等[15]發(fā)現XIAP在肝癌細胞與癌組織中表達升高，而正常的肝細胞與肝組織中卻呈低表達狀態(tài)。XIAP可能通過細胞的凋亡調控參與了肝細胞癌的發(fā)生和發(fā)展，它的過表達與肝細胞癌發(fā)生發(fā)展相關，為肝癌發(fā)生預測和早期診斷新靶標的發(fā)現與驗證提供了一定的研究依據[16]。然而在膽脂瘤中XIAP的表達明顯下調，與膽脂瘤上皮的凋亡密切相關，提示XIAP可能參與膽脂瘤上皮的凋亡調控過程，在膽脂瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用，可見其參與凋亡的功能具有復雜性，或許還有不同組織細胞的選擇性[17]。

另外有研究發(fā)現XIAP也在其他一些非腫瘤疾病中起著重要的作用。如Mufti等[18]發(fā)現，在 Wilson病、其他銅代謝紊亂和培養(yǎng)細胞的高銅水平時，XIAP能大大降低細胞內銅聚集。通過 XIAP調控細胞凋亡和銅排泄可以降低細胞內銅水平，為Wilson病提供了可能的治療途徑。XIAP還參與帕金森病、阿爾茨海默病、亨廷頓病、癲癇等許多神經系統(tǒng)疾病的病理生理過程，涉及了疾病的發(fā)病機制[19-22]。進一步深入研究它們的相互調控機制，將為許多神經系統(tǒng)疾病的多靶點防治提供選擇。

綜上所述，XIAP與很多腫瘤及神經系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的關系，進一步深入和細致的功能研究還在進行。本研究通過構建XIAP原核表達載體，表達純化XIAP重組蛋白，制備多抗血清，可為XIAP蛋白結構和功能的研究及診斷試劑的研制進而應用于臨床疾病診治奠定基礎。

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