反復(fù)腹痛患兒及家庭成員中幽門螺桿菌感染和外周血淋巴細(xì)胞亞群變化的研究①

黃永琴 劉 梅 曹 佳 馬麗菊 黃永坤 戚 勤 周麗芳

(云南省昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒科，昆明650032)

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)是一種螺旋狀、微需氧革蘭陰性桿菌，主要定植于人胃粘膜，長(zhǎng)期與人類宿主共生。具有很強(qiáng)的感染性，全球仍有一半的人口感染Hp[1]。發(fā)展中國(guó)家感染率較高，兒童感染率超過(guò)成人。Hp被公認(rèn)為是慢性胃炎、消化性潰瘍的致病因素，也與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)。但Hp感染的致病機(jī)制仍不是很清楚，除本身的動(dòng)力裝置、粘附特性以及各種毒力因子引起粘膜損傷致病外，宿主免疫功能異常亦是Hp致病的重要機(jī)制。本研究以家庭為單位，對(duì)11個(gè)家庭反復(fù)腹痛患兒及家庭成員50名及55名正常對(duì)照行外周血淋巴細(xì)胞亞群 CD3+(%)、CD19+(%)、CD4+(%)、CD8+(%)、CD16+56(%)、CD4+/CD8+檢測(cè)，以了解幽門螺桿菌感染反復(fù)腹痛患兒及家庭成員外周血淋巴細(xì)胞亞群的變化。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇3歲至14歲因反復(fù)腹痛半年以上來(lái)我科就診的患兒及其一級(jí)和二級(jí)親屬列為研究對(duì)象，其標(biāo)準(zhǔn):①在云南出生且生活3年以上;②無(wú)嚴(yán)重的心、肺、腦、腎、皮膚、營(yíng)養(yǎng)、內(nèi)分泌疾病及免疫缺陷病;③近4周內(nèi)無(wú)服用抗生素、鉍劑、質(zhì)子泵阻滯劑和激素史。共有11個(gè)家庭50名成員符合條件。55名志愿者(包括來(lái)醫(yī)院體檢中心進(jìn)行體檢的健康者和在校大學(xué)生)所有研究對(duì)象必須身體健康。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本采集 征得患兒父母和家庭其他成員知情同意，采用EDTA抗凝管抽取3 ml靜脈血，2 ml提取血漿行Hp抗體及分型檢測(cè)。1 ml行淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)材料 ①Hp免疫印跡試劑盒 (試劑由深圳市伯勞特生物制品有限公司提供，批號(hào):101126)。每個(gè)試劑盒包括兩瓶25 ml濃縮洗滌液(主要成分磷酸鹽緩沖液)、一瓶25 ml酶聯(lián)試劑(主要成分過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗人IgG)、一瓶25 ml顯色劑A(主要成分3，3一二氨基聯(lián)苯氨)、一瓶25 ml顯色劑B(主要成分H2O2)、一瓶25 ml終止液(主要成分H2SO4)、8條Hp抗原印跡薄膜和一張標(biāo)準(zhǔn)帶。②淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)試劑盒 BD SimultestTMIMK-lymphocyte(試劑由美國(guó)Becton Dickinson公司提供，批號(hào):340182)

1.2.3 檢測(cè)方法 ①Hp免疫印跡檢測(cè):按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，檢測(cè)Hp空泡毒素(CagA)、毒素相關(guān)蛋白抗體(VacA)、尿素酶A及B抗體(UreA、UreB)。當(dāng)CagA抗體(+)和/或VacA抗體(+)陽(yáng)性時(shí)，為Ⅰ型Hp感染;僅出現(xiàn)Ureas抗體(+)，為Ⅱ型Hp感染。三種抗體陰性即為Hp抗體陰性。Hp陰性者選為正常對(duì)照組。②外周血淋巴細(xì)胞亞群直接免疫熒光染色:在6個(gè)流式檢測(cè)管中分別加入 CD45-FITC/CD14-PE、CD3-FITC/CD19-PE、CD3-FITC/CD4-PE、CD3-FITC/CD8-PE、CD3-FITC/CD(16+56)-PE和陰性對(duì)照(IgG1-FITC/IgG2a-PE)各20 μl及 EDTA抗凝全血100 μl，室溫避光孵育20分鐘;加入溶血素2 ml作用10分鐘;離心洗滌后加入500 μl PBS緩沖液混勻后行流式細(xì)胞儀(FCM)分析。③FCM分析:美國(guó)Becton Dickinson公司流式細(xì)胞儀(FACScalibur)，激發(fā)光源FITC(530/30)nm，PE(585/42)nm，應(yīng)用 SimulSET軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.2.4 Hp感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)和分組 根據(jù)2007年8月10～12日在江西廬山召開(kāi)的第三次全國(guó)Hp共識(shí)會(huì)議提出的幽門螺桿菌診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]。11個(gè)家庭50名成員及55名志愿者中通過(guò)檢測(cè)幽門螺桿菌抗體和分型，選取幽門螺桿菌陰性者作為正常對(duì)照組。根據(jù)癥狀將研究對(duì)象分為腹痛組和正常對(duì)照組。另外再根據(jù)癥狀及年齡將研究對(duì)象分為腹痛患兒組、腹痛成人組及正常對(duì)照組。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，各指標(biāo)以±s表示，偏態(tài)分布及方差不齊采用秩和檢驗(yàn)，三組間比較采用單因素方差分析，其中兩兩比較采用SNK(q檢驗(yàn))，另外兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以α=0.05為統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為差異有顯著意義。

2 結(jié)果

2.1 Hp感染腹痛組和正常對(duì)照組淋巴細(xì)胞亞群結(jié)果(見(jiàn)表1) CD19+在三組間的值呈偏態(tài)分布和方差不齊采用秩和檢驗(yàn)，其余為近似正態(tài)分布采用t檢驗(yàn)。腹痛組外周血CD19+(%)較正常對(duì)照組增加(χ2=4.344，P=0.037)，腹痛組外周血 CD8+(%)顯著降低(t=-3.573，P=0.001)，腹痛組外周血CD4+/CD8+比值高于正常對(duì)照組(t=2.327，P=0.023)，另外兩組間比較外周血 CD3+(%)、CD4+(%)、CD16+56(%)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 Hp感染腹痛組及正常對(duì)照組外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果(%，±s)Tab.1 Peripheral blood lymphocyte subset between abdominal pain group with Hp infection and control group(%，±s)

表1 Hp感染腹痛組及正常對(duì)照組外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果(%，±s)Tab.1 Peripheral blood lymphocyte subset between abdominal pain group with Hp infection and control group(%，±s)

Th/Ts Abdominal pain 46 65.74±7.95 13.48±5.21 34.4 Group n CD3+ CD19+ CD4+ CD8+ CD16+56 8±7.09 26.48±6.24 19.33±7.54 1.38±0.46 Control 34 69.09±7.23 12.29±9.67 34.29±6.12 31.68±6.69 19.38±7.32 1.16±0.35 t value -1.963 4.344 0.122 -3.573 -0.033 2.327 P value 0.053 0.037 0.904 0.001 0.973 0.023

表2 Hp感染腹痛患兒、成人及正常對(duì)照組外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果(%，±s)Tab.2 Peripheral blood lymphocyte subset among children's and adult's abdominal pain group with Hp infection(%，±s)

表2 Hp感染腹痛患兒、成人及正常對(duì)照組外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果(%，±s)Tab.2 Peripheral blood lymphocyte subset among children's and adult's abdominal pain group with Hp infection(%，±s)

Th/Ts Child abdominal pain 11 65.45±8.37 16.55±5.89 32.09±4.85 27.64±5.77 16.18±6.68 1.20±0.26 Group n CD3+ CD19+ CD4+ CD8+ CD16+56 Adult's abdominal pain 35 65.83±7.94 12.51±4.65 35.23±7.56 26.11±6.41 20.31±7.61 1.43±0.50 Control 34 69.09±7.23 12.29±9.67 34.29±6.12 31.68±6.69 19.38±7.32 1.16±0.35 F value 1.858 8.989 0.936 6.574 1.316 4.109 P value 0.163 0.011 0.397 0.002 0.274 0.02

2.2 Hp感染腹痛患兒、成人及正常對(duì)照組外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果(見(jiàn)表2) CD19+在三組間的值呈偏態(tài)分布和方差不齊采用秩和檢驗(yàn)，其余為近似正態(tài)分布用采用單因素方差分析。腹痛患兒組CD19+(%)較腹痛成人組及正常對(duì)照組顯著增加(χ2=8.989，P=0.011)，腹痛成人組與正常對(duì)照組間兩兩比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。腹痛患兒組及腹痛成人組外周血CD8+(%)較正常對(duì)照組均顯著降低(F=6.574，P=0.002)，但腹痛患兒組與腹痛成人組兩兩比較，外周血CD8+(%)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。腹痛成人組外周血CD4+/CD8+比值高于正常對(duì)照組及腹痛患兒組(F=4.109，P=0.020)，但腹痛患兒組與正常對(duì)照組間兩兩比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

Hp感染患者的胃粘膜中存在大量B細(xì)胞，同時(shí)檢測(cè)到高滴度的IgG、IgM和IgA。在患者活檢組織中，亦能觀察到抗體包被細(xì)菌的現(xiàn)象，均提示存在活動(dòng)性體液免疫反應(yīng)。目前認(rèn)為Hp誘導(dǎo)宿主B細(xì)胞免疫應(yīng)答的途徑包括Hp可溶性產(chǎn)物的被動(dòng)吸收、上皮細(xì)胞直接內(nèi)吞細(xì)菌抗原、抗原通過(guò)被破壞的胃上皮進(jìn)入組織激發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答[3]。本研究中反復(fù)腹痛組外周血CD19+比正常對(duì)照組增加明顯，且反復(fù)腹痛患兒外周血CD19+比反復(fù)腹痛成人組增加，說(shuō)明Hp感染宿主致病時(shí)外周血B細(xì)胞增加，患兒組增加更明顯，B細(xì)胞免疫反應(yīng)活躍，這提示機(jī)體體液免疫反應(yīng)在Hp致病性中發(fā)揮著作用。

Hp感染時(shí)胃上皮細(xì)胞可呈遞抗原，起到非專職性抗原呈遞細(xì)胞的作用，進(jìn)而介導(dǎo)免疫反應(yīng)。宿主出現(xiàn)抗原特異性T細(xì)胞，主要是由于CD4+T輔助細(xì)胞在固有層內(nèi)積聚。研究表明慢性活動(dòng)性胃炎與CD4+/CD8+T細(xì)胞比例升高相關(guān)[4]。本研究11個(gè)家庭反復(fù)腹痛患兒及家庭成員46名Hp感染患者外周血CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞無(wú)明顯變化。CD8+T淋巴細(xì)胞明顯降低。CD4+/CD8+比值明顯升高與文獻(xiàn)相符，可能因粘膜局部淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)增加，則外周血中能檢測(cè)的淋巴細(xì)胞減少。本研究顯示抑制性T淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，輔助性T淋巴細(xì)胞數(shù)量相對(duì)增多，導(dǎo)致輔助性T淋巴細(xì)胞功能相對(duì)亢進(jìn)，抑制性T淋巴細(xì)胞功能相對(duì)不足，使T淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)失衡，引起細(xì)胞免疫損傷;同時(shí)導(dǎo)致B淋巴細(xì)胞功能亢迸，產(chǎn)生大量自身抗體，進(jìn)一步損傷機(jī)體。另外輔助性T淋巴細(xì)胞功能相對(duì)亢進(jìn)，可引起輔助性T細(xì)胞Th1型和Th2型應(yīng)答，可表現(xiàn)為Th1在胃粘膜內(nèi)發(fā)揮宿主免疫應(yīng)答并分泌炎性介質(zhì)白細(xì)胞介素(Interleukin，IL)12、IL-18、腫瘤壞死因子 α和干擾素γ等細(xì)胞因子;Th2細(xì)胞參與粘膜表面的分泌性免疫應(yīng)答和過(guò)敏反應(yīng)，分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等細(xì)胞因子，參與本類疾病的發(fā)病過(guò)程。

自然殺傷細(xì)胞(Natural killer cells，NK cells)的殺傷活性無(wú)MHC限制，不依賴抗體，因此稱為自然殺傷活性，NK細(xì)胞是不同于T、B淋巴細(xì)胞具有直接殺傷靶細(xì)胞效應(yīng)的特殊淋巴細(xì)胞。NK細(xì)胞作為固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，可以在無(wú)預(yù)先活化的情況下對(duì)病原體的入侵作出快速?gòu)V泛的應(yīng)答，殺傷靶細(xì)胞并釋放細(xì)胞因子，尤其是IFN-γ。NK細(xì)胞的效應(yīng)功能受宿主或病原體的調(diào)控，可以由NK細(xì)胞表面活化性受體與宿主或病原體細(xì)胞表面配體的結(jié)合而啟動(dòng)[5]。NK細(xì)胞也會(huì)對(duì)其它信號(hào)作出應(yīng)答，尤其是抗原提呈細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，誘導(dǎo)NK細(xì)胞對(duì)病原體的入侵發(fā)揮早期的宿主應(yīng)答[6]。本研究中11個(gè)家庭46名成員反復(fù)腹痛組外周血NK細(xì)胞與正常對(duì)照無(wú)差異，可能因Hp感染為慢性感染，NK細(xì)胞發(fā)揮作用在感染的早期有關(guān)。

本研究還發(fā)現(xiàn)在同一家族家庭成員中有的Hp感染患病，有的被感染而未患病，而同一家族家庭成員的生活方式和所處的環(huán)境基本相同，卻出現(xiàn)不同結(jié)果。說(shuō)明Hp感染致病性與宿主的自身免疫遺傳因素不同有密切關(guān)系。另外，本研究中發(fā)現(xiàn)CD8+T淋巴細(xì)胞明顯降低，且CD4+/CD8+比值明顯升高，基于Hp的慢性感染可通過(guò)B細(xì)胞激活并誘導(dǎo)自身抗體的產(chǎn)生而致自身免疫紊亂[7]。這提示Hp感染致病性與宿主的自身免疫遺傳因素有密切關(guān)系。

總之，Hp感染反復(fù)腹痛患兒及家庭成員外周血淋巴細(xì)胞亞群存在明顯異常，B細(xì)胞免疫應(yīng)答及T細(xì)胞免疫應(yīng)答均較活躍，可能與疾病的進(jìn)展及不同結(jié)局有關(guān)。本研究提示外周血淋巴細(xì)胞亞群異常與Hp感染后的致病性相互間是有影響和內(nèi)在聯(lián)系的。

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