哮喘小鼠模型研究現(xiàn)狀分析①

杜 軍 郭宏偉 鄧家剛 (廣西中醫(yī)學院，南寧530001)

支氣管哮喘(Asthma)是一種由多種因素引起的以可逆性氣道阻塞、氣道高反應性和氣道炎癥為特征的變態(tài)反應性疾病。到目前為止，人類對哮喘發(fā)病的機制尚未十分明確[1]，而直接對人體進行實驗有很大的限制性，因此，有關哮喘發(fā)病原因、發(fā)病機制及藥物防治等方面的研究在相當程度上還需要通過動物實驗進行。近20年來利用動物模型研究支氣管哮喘方興未艾，曾用于制作哮喘模型的動物很多，包括:貓、狗、馬、猴、兔、羊、豚鼠、大鼠、小鼠。1995年以前所用動物均為豚鼠，1995年以后才逐漸有報道應用大鼠和小鼠進行哮喘的動物實驗。其中，小鼠免疫遺傳背景較為清楚，免疫系統(tǒng)認識已較全面深入，加上基因技術及生物測定技術的迅猛發(fā)展，小鼠在國內(nèi)外已成為最主要的哮喘動物模型，并且，建模的成功與否直接關系到實驗結果的好壞[2]。為了給哮喘研究提供一定的實驗依據(jù)和數(shù)據(jù)參考，本文查閱了2001年1月1日～2010年12月31日國內(nèi)15種中文核心期刊公開發(fā)表的有關小鼠哮喘的實驗研究論文，并對其中小鼠建模方法的研究進行系統(tǒng)的歸納和分析。

1 材料與方法

1.1 查閱的雜志種類和篇數(shù) 中華結核和呼吸雜志、中華兒科雜志、中華哮喘雜志、免疫學雜志、中華微生物和免疫學雜志、中國免疫學雜志、細胞與分子免疫學雜志、現(xiàn)代免疫學、國際免疫學雜志、中成藥、中國病理生理雜志、中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志、中國藥理學通報、中國藥學雜志、中國中藥雜志。查閱文獻篇數(shù)共計133篇。

1.2 年限 2001年1月1日～2010年12月31日

1.3 查閱方法 手工查閱，關鍵詞分別是小鼠、哮喘。

1.4 數(shù)據(jù)庫來源 中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(CNKI)。

1.5 文獻質(zhì)量 本文查閱的文獻中所用樣本均由正規(guī)實驗動物中心提供或代養(yǎng)，統(tǒng)計到的樣本數(shù)共有5 175個，根據(jù)實驗目的不同，樣本量從10個至150個不等，分組后每組至少有5個樣本，所有樣本無死亡的。在用不同方法造模后，其中有4 470個樣本分別從肺組織的病理學改變、體征觀察方面，或用小鼠通氣功能檢測系統(tǒng)測定致敏小鼠通氣功能證實了所造模型的有效性，為可靠、有效的樣本，文獻統(tǒng)計中樣本有效率為86.38%。

2 結果

對所查文獻中提及到小鼠哮喘建模方法的全部內(nèi)容進行匯總、排序，并用Excel進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，結果如下。

2.1 小鼠的選擇

2.1.1 小鼠種類的選擇 實驗小鼠品系很多，根據(jù)不同繁殖方法而獲得的遺傳特性分為近交系、突變系、遠交群和雜交群。用作哮喘模型的小鼠主要是近交系小鼠。常用的品系有C57BL/6、BALB/c、A/J、CBA、C3H、昆明鼠系等，以前兩種品系使用最多。其中，BALB/c所用比例為79.5%，C57BL/6所用比例為13.9%，昆明鼠系所用比例為6.6%。

2.1.2 小鼠性別的選擇 所用實驗小鼠性別統(tǒng)計如下:雌性小鼠46.6%，雄性小鼠37.3%，雌雄不限16.1%。

2.1.3 小鼠周齡的選擇 根據(jù)實驗方法及目的的不同，所用小鼠的周齡也不相同，通常選用6至8周的小鼠，也有選用2～3天的幼鼠，或1至2個月的成年鼠，具體情況如下:見表1。

2.2 對致敏所用藥物 根據(jù)小鼠哮喘模型的不同，所用致敏藥物歸納如下:

2.2.1 變態(tài)反應性炎癥哮喘模型 常用的抗原有雞卵白蛋白(OVA)、塵螨、花粉、蟑螂等，其中OVA由于免疫原性強、價格低廉、來源方便，最為常用，并且多與免疫佐劑(主要為氫氧化鋁)聯(lián)合使用。

2.2.2 氣道重塑模型 此模型是以OVA反復多次致敏，抗原激發(fā)時間要比較前一模型長，主要以氣道平滑肌增生肥厚以及不可逆性氣道狹窄為主要表現(xiàn)。

2.2.3 生物因素誘導的哮喘模型 目前已建立一些病毒、真菌、細菌引起的哮喘模型，如呼吸道合胞病毒、霉菌金龜子綠僵菌在對前述范圍的文獻統(tǒng)計整理后，發(fā)現(xiàn)目前國內(nèi)主要是以變態(tài)反應性炎癥模型為主要研究對象，其中 OVA所用比例占到了89.3%，塵螨(包括粉塵螨、屋塵螨)占1.6%和蟑螂(美洲大蠊、德國小蠊)占2.5%，有研究氣道重塑的會考慮第二種模型。第三種模型占到6.6%，誘導因素主要是呼吸道合胞病毒。

2.3 對致敏方法的統(tǒng)計 上述文獻所用致敏方法如下(主要是OVA致敏):腹腔注射占84.6%;皮下注射占4.3%;腹腔與皮下注射占8.5%;還有用尾根部皮下注射，以及足墊皮內(nèi)注射與多部位同時注射各占0.8%。

2.4 對致敏劑量和次數(shù)的統(tǒng)計 雖然國內(nèi)對致敏因素的選擇較為一致，主要選用OVA，但致敏劑量和致敏次數(shù)的差異卻很大，現(xiàn)將結果統(tǒng)計如下:

表1 鼠周齡的選擇與所占比例Tab.1 The choice of mice age and its proportion

表3中28次致敏為連續(xù)4周，42次為連續(xù)6周，致敏時間在2周以上者，主要為氣道重塑模型。其中選用OVA致敏2次的占一半以上，但2次的具體時間各有差異，現(xiàn)將此結果統(tǒng)計如表4。

2.5 激發(fā)所用方法及天數(shù)的統(tǒng)計

2.5.1 激發(fā)方法 常用的激發(fā)方法主要有兩種，即霧化激發(fā)法和滴鼻激發(fā)法，其中使用霧化方法占79.3%，使用滴鼻法占19.0%，也有使用氣管內(nèi)注射與霧化結合，以及尾靜脈注射的，各占0.8%。

2.5.2 激發(fā)天數(shù) 對上述文獻資料統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，在建模時所需激發(fā)天數(shù)也有很大差異，統(tǒng)計結果按使用頻率由多至少依次如表5。

2.6 致敏與激發(fā)間隔天數(shù) 見表6。

表2 OVA致敏劑量范圍與所占比例Tab.2 Sensitization dose of OVA and its proportion

表3 OVA致敏次數(shù)與所占比例Tab.3 The times of sensitization and its proportion

表4 OVA致敏2次的具體時間與所占比例Tab.4 The specific time of 2 times sensitization and its proportion

表5 OVA激發(fā)天數(shù)及所占比例Tab.5 The days with OVA stimulating and its proportion

表6 致敏與激發(fā)間隔天數(shù)與所占比例Tab.6 The days between sensitization and stimulation and its proportion

3 討論

3.1 對所選小鼠品系、種類、性別的分析與討論據(jù)上述統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，所用小鼠種類以SPF級6～8周齡BALB/c最為多見，且所用雌性小鼠比例略高于雄性小鼠。這是因為BALB/c小鼠易產(chǎn)生針對OVA和花粉的高滴度IgE和氣道高反應性(AHR)，其實驗結果相對穩(wěn)定。而在運用塵螨作為誘發(fā)因素時會考慮使用C57BL/6小鼠[3]。在小鼠性別選擇的方面，國外有學者發(fā)現(xiàn)在OVA誘發(fā)成熟雌/雄性BALB/c小鼠的遲發(fā)性氣道炎癥中，雄性BALB/c小鼠的嗜酸性粒細胞(EOS)和淋巴細胞浸潤的支氣管-細支氣管炎沒有雌性BALB/c小鼠嚴重，而且支氣管肺泡液中炎癥細胞數(shù)也較雌性少[4]。

3.2 對致敏方法的分析與討論 統(tǒng)計結果顯示，在哮喘實驗中，大多數(shù)采用 OVA(Sigma，GradeⅤ)作為致敏原，且用腹腔注射。使用劑量以10～100 μg為宜，但以10 μg最為常用，多數(shù)在第0天與第7天致敏2次。有學者曾對OVA所用致敏劑量進行過比較研究，發(fā)現(xiàn)10 μg劑量組較其他劑量組能誘導出明顯的肺部EOS浸潤、杯狀細胞增生、AHR及高滴度的IgE等與人類哮喘特征相似的指標[5]。另外在OVA致敏時常以Al(OH)3凝膠作為佐劑，多數(shù)采用 Sigma公司產(chǎn)品，也有應用國產(chǎn)分析純Al(OH)3，但是在實驗中發(fā)現(xiàn)國產(chǎn)分析純?nèi)芙舛容^差，致敏后小鼠腹部容易出現(xiàn)硬結，致敏吸附效果也相對較差。

3.3 對激發(fā)方法的分析與討論 變應原進入動物機體的途徑有多種，如霧化吸入、鼻腔滴入(in.)、腹腔注射(ip)、皮下注射(sc.)、氣管內(nèi)滴入(it)等。同一品系動物致敏與激發(fā)的方法也可不同[6]。統(tǒng)計結果表明，多數(shù)研究者采用霧化激發(fā)法，因為其設備簡單，且易于操作，但有研究發(fā)現(xiàn)滴鼻激發(fā)法建立的哮喘模型氣道炎癥及氣道高反應性比霧化法更為顯著[7]。但是滴鼻激發(fā)容易導致小鼠窒息死亡，嚴重影響實驗可比性，這可能是抑制其使用的原因之一。另外，哮喘開始激發(fā)的時間多數(shù)為末次致敏后間隔一周開始激發(fā)，連續(xù)數(shù)日，但也不盡相同。統(tǒng)計結果顯示，建模時所需激發(fā)天數(shù)差異較大，從1～56天不等，這可能與研究方向有關，對于炎癥性模型其致敏時間較短一般在3～14天，而對于氣道重塑模型致敏時間較長一般都在2周以上。

1 鞏 靜，劉北星.哮喘小鼠模型中小鼠外周血IL-1 8水平與肺中嗜酸性粒細胞測定[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2008;18(6):740-742.

2 朱艷芬，宋澤慶.小鼠支氣管哮喘模型的研究現(xiàn)狀[J].中華哮喘雜志，2009;3(4):311-314.

3 Pabst R.Animal models for asthma controversial aspects and unsolved problems[J].Pathobiology，2002-2003;70(5):252-254.

4 Hayashi T，Adachi Y，Hasegawa K et al.Less sensitivity for late airway inflammation in males than females in BALB/c mice[J].Scand J Immunol，2003;57(6):562-567.

5 Sakai K，Yokoyama A，Kohno N et al.Effect of different sensitizing dose of antigen in a murine model of atopic asthma[J].Clin Exp Immunol，1999;118(1):9-15.

6 于琨瑛，楊 慧，劉玉琳 et al.屋塵螨變應原重組體免疫治療的實驗研究[J]. 中國免疫學雜志，2007;23(7):656-659，663.

7 沈 璐，賴克方，姜 華 et al.不同激發(fā)方式對小鼠過敏性支氣管哮喘模型的影響[J].中華哮喘雜志，2009;3(6):404-408.