琥珀酸發酵過程中的產物抑制特征及樹脂吸附原位分離的研究*

楊冰，許穎，季君暉，張維，王萍麗，王小威，趙劍

(中國科學院理化技術研究所，北京，100190)

琥珀酸發酵過程中的產物抑制特征及樹脂吸附原位分離的研究*

楊冰，許穎，季君暉，張維，王萍麗，王小威，趙劍

(中國科學院理化技術研究所，北京，100190)

研究了使用Actinobacillus succinogenes菌種以葡萄糖為底物，發酵生產琥珀酸過程中的產物抑制特征，及使用原位分離技術(ISPR)來消除產物抑制現象，以提高底物轉化率。研究發現，該菌種的生長與發酵呈現出明顯的非偶聯特征，在菌體生長進入穩定期(30 h培養)后，開始大量合成產物琥珀酸。當發酵液中琥珀酸濃度高于25 g/L時，開始出現明顯的產物抑制作用，底物轉化效率逐漸降低。通過模擬發酵液篩選出了對琥珀酸有較強吸附的D301T、D301R、D303樹脂，并通過真實發酵篩選出了對發酵體系無毒性的D301R樹脂。最后通過5L發酵罐，對樹脂吸附原位分離發酵進行驗證，在接種后30h將樹脂D301R以40 g/L的量添加入5L發酵罐中，至發酵終點琥珀酸產量達到49.46 g/L(底物葡萄糖60 g/L)，底物葡萄糖轉化率達到82.43%，相比普通發酵過程，底物轉化率提高了21%。

原位分離，樹脂吸附，發酵，底物轉化率

琥珀酸及其衍生制品可應用到各個領域，包括表面活性劑、電鍍行業、食品行業、制藥以及新材料等，發酵法制備琥珀酸已經受到越來越廣泛的關注［1］。可發酵產琥珀酸的微生物有很多，包括Actinobacillus succinogenes［2］、Anaerobiospirillum succiniciproducens［3］、Mannheimia succiniciproducens［4］以 及 重 組 Eschrichia coli［5］等菌種。其中 A.succinogenes可以利用多種碳源并以琥珀酸為主要發酵產物，而且菌種具有較高的底物及產物耐受性，極具工業生產應用潛力。

A.succinogenes在分批發酵中可以最高耐受葡萄糖達到160 g/L，但當培養基中初始葡萄糖添加量超過65 g/L時，細胞量、琥珀酸產量、葡萄糖轉化率都有明顯的降低［6］。在生物反應過程中，生物細胞和酶都受到高濃度產物的反饋調節作用，使得生物細胞及酶的潛力不能充分發揮，造成產率和原料的轉化率難以提高［7］。雖然A.succinogenes可以耐受琥珀酸達42 g/L，但當琥珀酸濃度在20 g/L時細胞生長也會受到明顯的抑制，類似于其他發酵終產物的抑制作用［8］。

目前許多研究者都把研究焦點放在菌株改良和發酵培養基調控上，以提高發酵產量［9］，只有少量研究集中在產物抑制以及發酵產物分離上［10］。為改善生物反應過程中的產物抑制現象以實現高效連續的生物合成與轉化，一種將生物反應與產物分離耦合的技術(In Situ Production Removal，ISPR)已經逐漸成為國內外的研究熱點［11］。采用這種原位分離技術可選擇性地從培養液中連續分離有抑制性、毒性或不穩定性產物，不僅可使反應過程向生成產物的方向進行，同時還能大大降低產物的自然降解作用。目前研究的原位分離發酵技術有很多，包括膜發酵法、電滲析法、溶劑萃取法以及吸附法，從工業化生產角度來看，樹脂吸附法以其成本低、選擇性高、交換容量大、操作簡單易于自動控制等優點而更加具有競爭力。

本研究選擇使用A.succinogenes菌種進行發酵，研究琥珀酸發酵過程中菌體生長與產物合成的特征曲線以及產物抑制特征，利用樹脂吸附法進行原位分離發酵，使體系中琥珀酸濃度始終保持在較低的水平，以減少產物的反饋抑制作用，從而大大提高了發酵底物的轉化率。

1 實驗材料和實驗方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種保藏及活化

菌種A.ssuccinogenes，購自中國工業微生物菌種保藏管理中心，本實驗室采用10%(v/v)甘油于－20℃保藏。菌種使用時，先將保藏在冷凍甘油管中的菌液在40℃水浴中活化1min，接入肉湯培養基，39℃培養20 h，待菌液渾濁后再接入新鮮斜面培養基培養20 h，轉置4℃冰箱保存備用。

1.1.2 培養基

斜面培養基:胰蛋白胨大豆瓊脂30.0 g/L。

種子培養基(g/L):酵母粉 5.0，K2HPO415.5，NaHCO310，NaH2PO48.5，Na2S·9H2O 0.02%，種子液使用斜面接種，在接種后培養20h后菌液達到渾濁狀態備用;

發酵培養基(g/L):酵母粉10.0，K2HPO43.0，NaCl 1.0，CaCl20.2，MgCl20.2，VB1220 mg，葉酸 20 mg，核黃素 20 mg，煙酸 20 mg，對氨基苯甲酸 50 mg，生物素 10 mg，Vb16100 mg，硫胺素 20 mg，泛酸 50 mg。

以上培養基均在121℃，滅活15 min，所用試劑均為分析純，國產。

1.1.3 樹脂

吸附樹脂:ADS－5、ADS－7、ADS－8、D3520、D4020;弱堿性陰離子樹脂:D301R、D301T、D303、D296、D315、HZD－9，均為南開大學化工廠提供。將樹脂用蒸餾水洗滌2次，再用95%乙醇浸泡20h，將樹脂沖洗至無乙醇氣味為止。再用2%HCl溶液與2%NaOH溶液交替洗脫處理，最后用2%NaOH保留，洗脫至中性備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 琥珀酸發酵過程曲線繪制

采用5 L發酵罐進行發酵實驗，接種量為10%、發酵溫度39℃、攪拌速度180 r/min、100%CO2，通氣量50 mL/min，pH值6.5、5 mol/L NaOH調節酸度值，接種后每隔4～6h取樣1次，測定琥珀酸濃度及菌液濃度，發酵終點為發酵液中葡萄糖濃度不再變化或沒有產物生成為止。

1.2.2 產物抑制特征的研究

在產物對底物轉化的抑制特征實驗中，采用250 mL三角瓶搖床發酵，每組包含3個平行實驗，不同實驗組的初始發酵培養基中加入不同量的琥珀酸鈉鹽，空白對照組不加入琥珀酸鈉鹽。每個三角瓶中加入堿式MgCO360.0g/L調節發酵體系內pH及供給底物轉化所需 CO2，搖瓶發酵條件為:接種量10%，39℃，120 r/min，4 d。

1.2.3 原位分離樹脂的篩選

采用模擬發酵液:甲酸2.0 g/L，乙酸8.0 g/L，乳酸8.0 g/L，琥珀酸80.0 g/L，在3組共33只三角瓶中各加入100 mL模擬發酵液后，再分別加入11種不同型號樹脂各5 g，39℃，120 r/min搖床培養48 h后測定各三角瓶中模擬發酵液酸含量，計算各種樹脂吸附量。

1.2.4 吸附樹脂對發酵體系的毒性研究

在研究樹脂對發酵體系的毒性研究實驗中，采用250 mL三角瓶搖床發酵，每組包含3個平行實驗，將對琥珀酸有較強吸附的樹脂，分別加入到一系列250 mL的三角瓶中，再加入等量200 mL發酵培養基。每個三角瓶中加入堿式MgCO360.0g/L調節發酵體系內pH及供給底物轉化所需CO2，搖瓶發酵條件為:接種量為 10%、39℃、120 r/min，4 d。

1.2.5 原位分離發酵的驗證實驗

將對發酵體系無毒性的樹脂在接種30 h后加入到發酵罐中，自動控制發酵工藝參數，驗證使用樹脂原位分離技術對提高發酵產量及底物轉化率的效果。發酵條件:接種量為 10%，39℃，180 r/min，100%CO2，通氣量 50 mL/min，pH 值 6.5、5 mol/L NaOH 調節發酵液內pH值。

1.2.6 分析方法

發酵液中產物分析:HPLC(Agilent 1200);流動相為99%的稀H2SO4溶液(pH值3)與1%乙腈的混合液，流速1 mL/min，外標法定量，所用試劑均為色譜純。

搖瓶中樹脂吸附琥珀酸濃度(Cy)測定:將發酵液中樹脂過濾提取后裝入層析柱(Φ30 mm×250 mm)，2%NaOH洗脫，洗脫速率為1 mL/min，直至洗脫液為強堿性為止。使用HPLC測定洗脫液中琥珀酸濃度c1，洗脫液體積為V1，計算洗脫液中琥珀酸含量S=c1×V1，發酵罐中發酵液體積為V2，所以樹脂吸附琥珀酸濃度cy=c1×V1/V2。

發酵罐中樹脂吸附琥珀酸濃度(cf)測定:將發酵液中樹脂過濾提取后裝入層析柱(Φ80 mm×1 000 mm)，2%NaOH洗脫，洗脫速率為2 mL/min，直至洗脫液為強堿性為止。使用HPLC測定洗脫液中琥珀酸濃度c1，洗脫液體積為V1，計算洗脫液中琥珀酸含量S=c1×V1，發酵罐中發酵液體積為V2，所以樹脂吸附琥珀酸濃度cf=c1×V1/V2。

琥珀酸總量:(1)吸附樹脂毒性驗證實驗，琥珀酸總量S=c+cy，其中:c為發酵液中琥珀酸測定量。

(2)原位分離發酵驗證實驗，琥珀酸總量S=c+cf，其中:c為發酵液中琥珀酸測定量。

發酵液中菌液濃度測定:SP－721型可見光分光光度計，660 nm波長處測定。

發酵液中殘糖量測定:DNS法(3，5-二硝基水楊酸比色法)，SP－721型可見分光光度計，540 nm波長測定，外標法定量，所用試劑均為分析純。

2 實驗結果與討論

2.1 琥珀酸發酵過程曲線

琥珀酸是A.ssuccinogenes菌種的主要代謝產物，其分批發酵過程曲線如圖1所示。

圖1 琥珀酸發酵過程曲線

由圖1可以看出，A.succinogenes在分批發酵過程中，菌體生長在經過短暫的延滯期(約4 h)后，迅速進入對數生長期(約4～30 h)，此階段菌體量快速增長，直至最大值，隨后菌體繁殖速度明顯減慢，菌體量大致保持穩定。發酵開始由菌體生長期轉入產物合成期，琥珀酸開始逐漸積累，直至最高峰。之后菌體開始出現自溶，產物合成能力衰退。

菌體生長和琥珀酸合成表現出明顯的非偶聯特征，琥珀酸發酵過程可分成兩個區間，在接種后0～30h為菌體生長期，30～80h為產物合成期。在生長期產物的濃度很低，尚未達到對菌體生長產生抑制的濃度;進入產物合成期時，菌體生長幾乎停止，菌體進入穩定期。所以，如果在菌體生長進入穩定期后加入吸附樹脂，可以及時移走產物琥珀酸，大大降低其在發酵液中的濃度，減緩產物自身帶來的反饋抑制。

2.2 產物抑制特征

為了評估發酵產物在A.succinogenes發酵過程的抑制作用，在初始發酵培養基中添加不同濃度琥珀酸鹽，在底物葡萄糖為30 g/L和60 g/L的濃度下分別進行發酵實驗。

從圖2中可以看出，培養基中底物葡萄糖初始濃度為30 g/L時，琥珀酸鹽添加量高于25 g/L時就會產生較為明顯的抑制作用，發酵液中琥珀酸的產量較低，而乙酸及乳酸的產量也會受到影響，有降低的趨勢。琥珀酸鹽的添加可以引起較為明顯的產物抑制作用。在圖3中培養基底物葡萄糖初始濃度為60 g/L時，琥珀酸鹽添加量高于25 g/L時也會對發酵過程會產生抑制作用，但由于培養基中底物濃度較大，抑制作用較為緩和，同時受底物濃度大的影響，乙酸及乳酸的產量并未受到明顯影響。

圖2 葡萄糖濃度為30 g/L條件下酸產量

圖3 葡萄糖濃度為60 g/L條件下酸產量

無論底物葡萄糖濃度高低，琥珀酸鹽添加量與發酵終產物產量都符合一定的函數關系，產物的抑制作用都在25 g/L時開始出現。琥珀酸是在細胞內的三羧酸循環中受一系列酶催化而生成的，發酵液中琥珀酸濃度達到一定值時，就會對整個發酵體系產生反饋抑制，使得底物轉化率降低，產物生成量降低。雖然這種產物抑制現象會隨底物濃度的增加而減弱，但研究表明［8］，在分批發酵中當培養基中初始葡萄糖濃度超過65 g/L時，會使得細胞量、琥珀酸產量、葡萄糖轉化率都有明顯的降低。所以為了提高底物的轉化率，降低生產成本，增加琥珀酸的發酵產量，采用原位分離技術將發酵與分離相耦合，及時移走發酵產物，減少產物抑制是一種值得嘗試的方法。

2.3 原位分離樹脂篩選

采用模擬發酵液，對11種大孔吸附樹脂及弱堿性陰離子樹脂進行篩選，結果如圖4所示。

由圖4可以看出，11種樹脂中，D301R、D301T、D303對琥珀酸的吸附作用最為明顯，HZD－9和D315對琥珀酸吸附作用其次，D296對琥珀酸也有一定的吸附作用，而其他樹脂對琥珀酸的吸附能力較弱。其中D301R、D301T對乳酸也有較強的吸附作用，ADS－5、ADS－7、ADS－8、D3520、D4020 樹脂對模擬發酵液中的低分子乳酸、乙酸、琥珀酸的吸附量都很少。由于大孔吸附樹脂是靠良好的大孔網狀結構和較大的比表面積對溶液中的物質進行物理吸附，而弱堿性陰離子樹脂含有弱堿性基團OH－，樹脂的正電基團能與溶液中的陰離子吸附結合，從而產生陰離子交換，吸附模擬發酵液中的酸根離子，所以弱堿性陰離子樹脂D301R、D301T、D303對琥珀酸均有很強的吸附作用，對他們進行模擬原位吸附分離發酵實驗。

2.4 原位分離樹脂的毒性研究

原位分離發酵過程中，樹脂的性質對發酵體系的影響很大，樹脂是否有細胞毒性及對發酵體系的毒性影響，也需要充分的考量。實驗結果如圖5所示。

圖4 不同樹脂對模擬發酵液中各種酸的吸附量

圖5 添加不同型號樹脂的發酵體系發酵狀況

A.succinogenes是厭氧發酵，在葡萄糖轉化成琥珀酸的過程中，CO2的供給量決定了PEP羧化酶的活性，搖瓶發酵環境內的CO2供給靠添加的堿式提供，所以琥珀酸產量較發酵罐低。從圖5可以看出，經過4 d發酵，未加入樹脂的空白三角瓶發酵液中琥珀酸含量最高，加入樹脂D301R的搖瓶溶液中琥珀酸含量也較高，而加入樹脂D301R和D303的搖瓶內琥珀酸含量較低。將加入至各三角瓶內的樹脂洗脫后測定其吸附的琥珀酸量，可以看出D301R、D301T、D303三種樹脂的吸附量比較相近，與之前測定結果相符。計算后可以看出，加入樹脂D301R的搖瓶在整個發酵過程所產生的琥珀酸量最多，殘糖量最低，加入樹脂D301T和D303的搖瓶內所產生的琥珀酸量都較空白低。這說明樹脂D301R無細胞毒性，對細胞生長影響較小，對發酵體系也不存在毒性，隨著細胞進入生長穩定期，琥珀酸在發酵液中濃度增加，樹脂開始逐漸吸附部分琥珀酸，降低了琥珀酸在發酵液中的濃度，使得底物葡萄糖進一步向合成琥珀酸方向轉化，當樹脂吸附飽和時，發酵液中琥珀酸濃度趨于恒定，葡萄糖轉化停止，發酵終止。而添加了D301T和D303的搖瓶中，殘糖量和琥珀酸量都較空白搖瓶低，可能是由于樹脂的存在影響了微生物代謝產物合成的方向，使得代謝過程向其他分支進行，底物葡萄糖轉化成包含乳酸、甲酸、乙酸、琥珀酸在內的多種產物。

2.5 原位分離發酵驗證實驗

在實際發酵罐發酵過程中，發酵參數可以自動化控制，發酵體系更加穩定、容易操控，所以為了進一步考查在真實發酵體系中，原位分離技術對底物轉化率的影響，使用5L發酵罐進行發酵實驗。底物葡萄糖濃度為60 g/L，樹脂 D301R采用121℃高溫滅菌15min，在接種30 h后，以40 g/L的添加量加入到發酵罐中，實驗結果如圖6所示。

圖6 原位分離發酵與普通發酵結果對比

由圖6可以看出，普通發酵至終點時溶液中琥珀酸濃度為36.87 g/L，原位分離發酵至終點時溶液中琥珀酸濃度為34.21 g/L。原位分離樹脂吸附了15.25 g/L的琥珀酸，琥珀酸產量為49.46 g/L，殘糖量僅為7.58 g/L，產物轉化率達82.43%。通過原位分離，樹脂移走了發酵液中30%的產物。

根據之前的研究結果可知，在普通發酵過程中，當發酵液中琥珀酸濃度達到25 g/L時，底物轉化即受到了反饋抑制，轉化率降低，直到琥珀酸濃度為36.87 g/L時，底物及產物濃度不再變化，發酵終止。而在添加樹脂的原位分離發酵過程中，在琥珀酸合成初期，是一個邊發酵邊吸附的過程，樹脂的添加可以有效地將發酵液中琥珀酸濃度控制在較低的水平，降低了產物的反饋抑制作用，為底物的持續高效轉化提供了良好的基礎。

采用原位分離技術，可以將琥珀酸產量提高至49.46 g/L，底物轉化率由61.45%提高至82.43%，在一定程度上提高了琥珀酸的產量和底物的轉化率，該工藝為放大生產工藝中節約成本，提高發酵效率提供了基礎和參考。

3 結論

使用A.succinogenes菌種進行分批發酵，當發酵液中琥珀酸濃度達到25 g/L時，即出現產物反饋抑制的現象。在發酵過程中加入篩選后的弱堿性陰離子樹脂D301R，進行原位吸附分離發酵可以很好地解決發酵過程的產物抑制，實現了產物的邊合成邊吸附，使產物濃度在發酵液中保持較低水平。使用該發酵工藝可將琥珀酸發酵底物的轉化率從61.45%提高至82.43%，既提高了發酵底物的轉化率，又減輕了下游產物回收的壓力，是一種比較值得深入研究的技術方法。

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The Study on the Characteristic of Product Inhibition and the in Situ Product Pemoval Using Resin Adsorption in Succinic Acid Fermentation Process

Yang Bing，Xu Ying，Ji Jun-hui，Zhang Wei，Wang Ping-li，Wang Xiao-wei，Zhao Jian
(Technical Institute of Physics and Chemistry，China Academy of Sciences，Beijing 100190)

The characteristics of product inhibition on the growth of Actinobacillus succinogenes in fermentation using glucose as the major carbon source and the technology of the In Situ Product Removal(ISPR)with resin adsorption to alleviate the product inhibition were studied.The study showed that the characteristic of the cells growing process and the succinic acid synthesizing process was non－coupling，which means that the cells started to synthesize succinic acid in the stationary growth stage(after cultivation for 30 hours).The product inhibition became more and more obvious when the succinic acid concentration was over 25g/L in the fermentation broth，and the conversion rate of the substrate became decreased.Through simulative fermentation broth，resin of D301T，D301R and D303 have been selected，which have great adsorptive capacity of the succinic acid.D301R was innocuous in the ISPR，which was finally ascertained by using in the real fermentation system.Application effect of the ISPR with resin was confirmed through 5L automatic fermentor，and 40 g/L D301R resin was added after 30 hours cultivation.After the fermentation process was finished，the concentration of the succinic acid can reach 49.46g/L(the substrate of glucose is 60 g/L)and the glucose conversion rate can reach 82.43%，the substrate conversion rate was increased by 21%comparing with usual fermentation Method.

In Situ Product Removal(ISPR)，resin，fermentation，substrate conversion rate