金針菇子實體多糖的抗氧化活性的研究

傅明輝，洪梅達

（廣東工業大學 食品與生物工程系，廣東 廣州 510006）

食用菌多糖具有免疫調節，抗腫瘤作用，調節血糖、降血脂作用，抗氧化，抗衰老作用以及抗輻射和抗突變作用，廣泛應用于臨床治療以及保健功能上。如香菇多糖具有廣譜的抗病毒、抗腫瘤及刺激巨噬細胞活性和對膽固醇的溶解作用，并能作為調節機體免疫反應的T細胞促進劑，通過刺激抗體的產生提高機體的免疫功能[1-5]；靈芝子實體多糖能增強巨噬細胞的吞噬活力，促進蛋白質合成，改善造血功能，增強機體的防御功能[5-6]，同時具有降血糖、降血脂的作用[7-8]。茶樹菇子實體多糖具有抗氧化的活性[9]。

金針菇（Flammulina velutipes）又名樸菇、冬菇，是一種常見食用菌，具有豐富的營養價值。據分析，金針菇（干制品）含有豐富的蛋白質（31.2%）、碳水化合物（60.2%）和粗脂肪（5.8%），還含有VB1、VB2、VC等多種維生素，其含量豐富的精氨酸和賴氨酸對促進少年兒童智力發育具有良好作用，日本人把它譽為“增智菇”[10]。金針菇不但食用價值高，還具有一定的藥用價值。據報道，其子實體提取物具有保肝及抗腫瘤作用[11-12]，其多糖是一個以葡聚糖為主、由數個多糖組分構成的混合多糖[13]，能夠增強機體免疫力[14]，具有抗凝血[15]等生理功能，但有關金針菇多糖的抗氧化作用的研究還鮮有報道。本文對金針菇多糖進行分離、純化并對其抗氧化活性進行研究，研究結果為金針菇多糖的進一步開發和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金針菇：購自廣州長湴市場。昆明種小白鼠：購自廣州中醫藥大學實驗動物中心。DEAE52、Sephadex S-200：Sigma公司；其余化學試劑均為國產。

1.2 儀器與設備

高速組織搗碎機（DS-1型）：上海標本模型廠制造；旋轉蒸發器（RE-52A型）：上海亞榮生化儀器廠；低速離心機（KDC-40型）：大創新股份有限公司中佳分公司；可見分光光度計（1201型）：北京瑞利分析儀器公司；自動部分收集器（BSZ-100）：上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取

稱取100 g新鮮金針菇子實體，加適量蒸餾水，勻漿。保持料液比為1∶40（g∶mL），在100 ℃水浴中加熱攪拌3 h，過濾，如此反復3次，合并收集濾液，離心30 min（4000 r/min），取上清液濃縮至小體積。加入3倍體積的無水乙醇沉淀，離心，收集沉淀。將沉淀溶解于水中，在透析袋中，對自來水透析24 h，再對蒸餾水透析48 h。Sevage法脫蛋白，重復脫蛋白5次。加入3倍體積無水乙醇沉淀，在4℃冰箱中靜置過夜。離心，收集沉淀，以無水乙醇洗滌。離心15 min（4000 r/min），除去乙醇，干燥，得粗多糖。樣品中蛋白質含量的測定采用考馬斯亮藍法。

1.3.2 多糖的DEAE離子交換柱層析

DEAE52-纖維素離子交換柱層析（10 mm×200 mm），用0.05mol/L NaCl溶液洗脫，流速0.75mL/min，收集4 mL/管，苯酚-硫酸顯色法測定多糖含量。65℃～70℃減壓旋轉蒸發樣液，濃縮至1 mL后，真空干燥獲得純多糖A1和A2。

1.3.3 多糖的凝膠柱層析

取經DEAE柱純化得到的多糖A2樣品，用少量0.05 mol/L NaCl溶液溶解，65℃～70℃減壓旋轉蒸發濃縮至1 mL～2 mL。樣品加入Sephadex S-200凝膠柱中（16 mm×500 mm），用濃度為0.05 mol/L NaCl溶液洗脫，流速0.2 mL/min，收集2 mL/管，苯酚-硫酸顯色法測定多糖。

1.3.4 多糖抗氧化活性的檢測[16]

選取體重20 g左右的健康小鼠，脫頸椎處死，取肝臟以0.9%生理鹽水研磨成2%的勻漿液。取1.5 mL勻漿液，加入0.5 mL純化后的A2組分（或生理鹽水作對照），混勻，靜置10min，然后放入37℃恒溫箱中振蕩1.5h，取出加入1.5 mL 20%三氯乙酸，混勻以終止氧化反應，10 min后1000 r/min離心10 min。取上清液1.5 mL加入0.5 mL 0.67%硫代巴比妥酸，沸水浴10 min，冷卻后用分光光度計測光密度（波長=540 nm）。另取1.5 mL勻漿液，加入1.5 mL 20%三氯乙酸先終止反應，然后再加入0.5 mL純化后的A2組分（或生理鹽水），余下步驟同上，用作空白調零，取3個不同濃度的樣品，每個濃度分別取3支平行管，記錄結果。

2 結果與分析

2.1 多糖的分離與純化

100g新鮮金針菇經熱水浸提后制備粗多糖1.092g，提取率1.092%。

粗多糖經DEAE52-離子交換柱后的結果見圖1，圖中可見2個明顯的峰，說明粗多糖中包含2種組分A1和A2（A1和A2不一定是純品）。多糖A2再經過SephadexS-200凝膠柱層析后，結果見圖2，得到一個基本對稱單峰，說明A2組分是純的多糖。

圖1 DEAE52柱層析洗脫圖譜Fig.1 The elution curve of DEAE52 column chromatography

2.2 多糖抗氧化活性的測定

金針菇多糖樣品抗氧化活性檢測數據如表1所示。

圖2 Sephadex S-200柱層析洗脫曲線Fig.2 The elution curve of Sephadex S-200 column chromatography

表1 金針菇多糖的抗氧化作用Table 1 The anti-oxidant activity of polysaccharide from Flammulina velutipes

本實驗的結果顯示，生理鹽水為對照，金針菇多糖的3個濃度均有抗氧化作用。在樣品濃度較低，為0.007 mg/mL時，OD值下降了36.5%，隨著樣品濃度升高到0.014 mg/mL和0.028 mg/mL時，OD值下降百分率分別達到40.0%及48.5%，其光密度降低都具有比較明顯的差異，量效關系顯著，即隨著濃度的升高，抗氧化作用明顯上升。

3 結論

我國是食用菌生產大國，食用菌的開發和利用具有重要的意義。食用菌多糖是食用菌中一種重要的活性物質，具有抗腫瘤、抗病毒及提高機體免疫功能等生物學活性，這在香菇、靈芝、蟲草、姬松茸等常見食用菌中以得到證實[1-9，17-19]，金針菇多糖也具有抗腫瘤、提高機體免疫的活性，但有關金針菇多糖的抗氧化研究鮮有報道。本研究采用熱水浸提的方法分離金針菇多糖，結合DEAE52-纖維素離子交換柱層析和Sephadex S-200凝膠柱層析純化多糖，得到單一多糖組分A2，并對其抗氧化活性進行了研究，研究結果表明金針菇具有明顯的抗氧化活性，且抗氧化活性呈現劑量效應，隨濃度升高而升高，該研究結果為金針菇的進一步開發和利用提供一定的參考。

[1]劉美琴，李建中，孔繁祚.香菇菌絲體多糖的分離鑒定與免疫功能研究[J].生物化學與生物物理學報，1999,31(1):46-50

[2]王育生，楊昭玲，劉曉玲，等.腹腔注射香菇多糖治療晚期胃腸道腫瘤所致惡性腹腔積液的臨床觀察[J].腫瘤研究與臨床，2006，18(11):764-765

[3]Lee H H,Lee J S,Cho J Y,et al.Study on Immunostimulating Activity of Macrophage Treated with Purified Polysaccharides from Liquid Culture and Fruiting Body of Lentinus edodes[J].J Microbiol Biotechnol,2009,19(6):566-572

[4]Yu S,Weaver V,Mabtin K,et al.The effects of whole mushrooms during inflammation[J].BMC Immunol,2009,10:12-34

[5]方晶，李從強，柯麗霞，等.食用菌多糖的研究[J].微生物學雜志，2008，28(2):57-60

[6]易輝偉，李德遠，劉德強.靈芝多搪對小鼠免疫調節實驗研究[J].中國現代臨床醫學雜志，2006，5(10):1-3

[7]羅少洪，陳偉強，黃韜,等.靈芝多糖對高血脂大鼠血脂水平的影響[J].廣東藥學院學報，2005，21(5):589-590

[8]黃智璇，歐陽蒲月.靈芝多糖降血糖作用的研究 [J].食用菌，2009，31(1):60-61

[9]傅明輝，葉秀儀，郭秀蘋，等.茶薪菇子實體多糖的分離純化和抗氧化活性測定[J].藥物生物技術，2004，11(5):321-323

[10]盧憲.食用菌菌絲體氨基酸含量分析[J].食用菌學報，1999，6(2):25-29

[11]吳希哲，高向東.金針菇提取物的保肝和抗腫瘤作用[J].中國生化藥物雜志，2002,23(4):176-178

[12]苗立成，王立強，吳迪.金針菇多糖對小鼠抗腫瘤及抗白血病效應的實驗研究[J].解放軍藥學學報，2003，19(3):171-173

[13]秦小明，余娟，寧恩創，等.金針菇子實體多糖成分的初步研究[J].食用菌學報，2005，12(2):27-31

[14]朱曙東，嚴茂祥，陳芝蕓，等.金針菇多糖免疫活性的研究[J].浙江中醫學院學報，2001,25(4):43-44

[15]嚴茂祥，陳芝蕓，項柏康，等.金針菇多糖對小鼠血清溶血素產生及抗體形成細胞的影響[J].中醫藥信息，2003，20(5):56-57

[16]許實波，唐孝禮，李瑞聲，等.海蛾提取物對機體抗氧化、抗炎及免疫功能的影響[J].中山大學學報：自然科學版，1990,29（增刊）:105-111

[17]Zhang W,Yang W,Chen J,et al.Immunomodulatory and antitumor effects of an exopolysaccharide fraction from cultivated Cordyceps sinensis (Chinese caterpillar fungus)on tumor-bearing mice[J].Biotechnol Appl Biochem,2004,15(12):256-257

[18]Gonzaa M L,Bezerra D P,Alves A P,et al.In vivo growth-inhibition of Sarcoma 180 by an alpha-(1-->4)-glucan-beta-(1-->6)-glucan-protein complex polysaccharide obtained from Agaricus blazei Murill[J].Nat Med(Tokyo),2009,63(1):32-40

[19]Jiang Y H,Jiang X L,Wang P,et al.The antitumor and antioxidative activities of polysaccharides isolated from Isaria farinose B05[J].Microbiological research,2008,163(4):424-430