荷葉黃酮的復(fù)合法提取及清除自由基的研究

金德寬，孫芝楊

（江蘇食品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 淮安 223003）

荷葉黃酮的復(fù)合法提取及清除自由基的研究

金德寬，孫芝楊

（江蘇食品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 淮安 223003）

超聲波與微波復(fù)合法提取荷葉中黃酮類化合物，最佳提取條件為乙醇濃度60%、料液比1∶25、超聲提取時間25 min、微波功率462 W、微波提取時間90 s，荷葉黃酮提取率為2.45%。荷葉黃酮清除羥自由基和超氧陰離子自由基能力的研究表明，在荷葉黃酮分別為125 mg/L和3.5 mg/L（以蘆丁計(jì)）時，可以清除50%的羥自由基和超氧陰離子自由基。實(shí)驗(yàn)表明，荷葉黃酮對羥自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除效果，進(jìn)而為荷葉作為天然抗氧化劑提供了參考。

荷葉；黃酮；提取；自由基

荷葉是睡蓮植物中國蓮（nelumbo nucifera）的葉片。近年來對荷葉的研究發(fā)現(xiàn)，荷葉中富含黃酮類化合物，荷葉黃酮具有多種生物活性，如調(diào)脂作用、抗氧化、抗衰老、清除自由基和抑制脂肪肝作用等[1]。《本草綱目》記載“荷葉服之，令人瘦劣。”臨床亦將其廣泛用于肥胖癥及高脂血癥，并取得了較好療效[2]。1991年11月，在中華人民共和國衛(wèi)生部的衛(wèi)監(jiān)發(fā)第45號文件中，荷葉被列入第2批“既是食品又是藥品”的名單中。

自由基是含有未配對電子的物質(zhì)，人們發(fā)現(xiàn)很多疾病都與自由基有密切的關(guān)系。人類的多種疾病包括腫瘤、心腦血管病、糖尿病、老年癡呆癥都與活性氧自由基（包括羥自由基、超氧陰離子自由基等）有關(guān)[3-4]。隨著自由基引起人們的關(guān)注，從天然植物中提取抗氧化成分來清除自由基成為研究的熱點(diǎn)。判斷物質(zhì)清除自由基能力的常用方法有分光光度法、熒光光度法等。

羥自由基是最活潑最具危害性的自由基,往往很難清除，氧化劑H2O2可通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生活性更強(qiáng)的羥自由基[5]。由于羥自由基存在時間短，難以直接測定。超氧陰離子自由基是生物體內(nèi)最早產(chǎn)生的自由基，它的存在能夠直接或間接地引起生物大分子的氧化破壞，誘發(fā)脂質(zhì)過氧化，降低膜流動性，是生物衰老和許多疾病產(chǎn)生的主要原因[6]。

靳素榮[7]和蔡為榮[8]分別使用超聲波、微波法提取荷葉中黃酮類化合物，而采用超聲波與微波復(fù)合法提取荷葉中黃酮類化合物的研究鮮見報道。利用熒光分光光度法研究提取物清除羥自由基、分光光度法研究提取物超氧離子自由基，對于利用天然植物中提取抗氧化成分來清除自由基具有非常重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 原料

新鮮荷葉采自江蘇省淮安地區(qū)。

1.1.2 試劑

蘆丁、2-氨乙基一二苯基硼酸鹽（sigma公司）；乙醇以及其他試劑均為分析純。

1.1.3 儀器

UV-2401PC紫外-可見分光光度計(jì)：日本Shimadzu公司；GFY-160熒光分光光度計(jì)：廈門分析儀器廠；KQ250B超聲波清洗器：上海江儀儀器有限公司；101A-4電熱鼓風(fēng)干燥箱：無錫市蘭博試驗(yàn)設(shè)備有限公司；P70D20TL-D4格蘭仕微波爐：佛山市順德區(qū)格蘭仕微波爐電器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 荷葉黃酮的提取方法

新鮮荷葉于60℃鼓風(fēng)烘干至水分小于10%，粉碎，過40目篩，即得荷葉粉，真空密封閉光保存?zhèn)溆谩?zhǔn)確稱取荷葉干粉2 g，于250 mL錐形瓶中，按一定的料液比加入乙醇水溶液，常溫下超聲波提取一定時間，過濾、定容。然后，微波法提取一定時間，過濾、定容。

1.2.1.1 乙醇濃度對提取率的影響

在料液比（荷葉克數(shù)與溶劑的毫升比，g/mL）為0.05 g/mL（1∶20）超聲提取時間20min、微波功率280W、微波提取時間60 s的條件下，選用乙醇濃度為40%、50%、60%、70%、80%的溶劑提取荷葉中的黃酮類化合物。研究乙醇濃度對提取率的影響。

1.2.1.2 料液比對提取率的影響

在乙醇濃度為50%、超聲提取時間20 min、微波功率280 W、微波提取時間60 s的條件下，選用料液比為0.100 g/mL（1∶10）、0.067 g/mL（1∶15）、0.05 g/mL（1∶20）、0.04 g/mL（1∶25）和0.033 g/mL（1∶30）溶劑提取荷葉中的黃酮類化合物。研究料液比對提取率的影響。

1.2.1.3 超聲波處理時間對提取率的影響

在料液比0.05 g/mL（1∶20）、乙醇濃度50%、微波功率280 W、微波提取時間60 s的條件下，選擇不同的提取時間（10、15、20、25、30 min）提取荷葉中的黃酮類化合物。研究超聲波處理時間對提取率的影響。

1.2.1.4 微波功率對提取率的影響

在料液比0.05 g/mL（1∶20）、乙醇濃度50%、超聲提取時間20 min、微波提取時間60 s的條件下，選擇不同的微波功率（119、280、462、595、700 W）提取荷葉中的黃酮類化合物。研究微波功率對提取率的影響。

1.2.1.5 微波處理時間對提取率的影響

在料液比0.05 g/mL（1∶20）、乙醇濃度50%、超聲提取時間20 min、微波功率280 W的條件下，選擇不同的微波提取時間（30、60、90、120、150 s）提取荷葉中的黃酮類化合物。研究微波處理時間對提取率的影響。

1.2.1.6 正交試驗(yàn)確定最佳提取工藝

根據(jù)1.2.1.1～1.2.1.5的單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選擇不同的乙醇濃度、料液比、超聲波處理時間、微波功率和微波處理時間，以提取率作為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。

1.2.2 荷葉黃酮含量測定

以蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)物，參照文獻(xiàn)[9]的方法，測定荷葉中黃酮的含量。

1.2.3 荷葉黃酮清除羥自由基（熒光光度法）

[10]的方法進(jìn)行，根據(jù)儀器條件，激發(fā)波長和發(fā)射波長改為365 nm和370 nm。

1.2.4 荷葉黃酮清除超氧陰離子自由基（分光光度法）

參照文獻(xiàn)[11]的方法進(jìn)行。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)以平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)偏差（M±SD）表示，使用Microsoft Office Excel 2003和正交設(shè)計(jì)助手IIV3.1作圖表以及進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 荷葉黃酮提取條件的選擇

2.1.1 乙醇濃度對提取率的影響

用不同濃度的乙醇提取荷葉黃酮，隨著乙醇濃度的增加，可以提出更多的黃酮。60%～70%的乙醇提取效果最好，繼續(xù)提高乙醇濃度，效果反而變差見圖1。

2.1.2 料液比對提取效果的影響

以不同料液比的50%乙醇提取荷葉黃酮，提取效果隨著溶劑量的增加而提高，在料液比達(dá)到1∶25后，黃酮提取率不再提高，見圖2。

2.1.3 超聲波處理時間對提取效果的影響

超聲波提取時間對提取效果有較大的影響。在超聲波的作用下，基體的細(xì)胞膜在很短時間內(nèi)急劇膨脹破裂，被萃取的黃酮類化合物迅速進(jìn)入溶劑，見圖3。

在0～25 min內(nèi)，提取率隨著超聲波處理時間的增加而提高。在25 min以后，延長提取時間對提取率的影響不大，原因可能是隨著時間的增加，樣品中黏液質(zhì)等雜質(zhì)進(jìn)入浸提液。使浸提液黏度增大，擴(kuò)散速度變慢，導(dǎo)致黃酮類化合物不易溶出[7]。

2.1.4 微波功率對提取效果的影響

微波功率對提取效果的影響，見圖4。

荷葉黃酮在極性瞬間變化的微場變化中分子旋轉(zhuǎn)、振動或擺動，加劇反應(yīng)物分子運(yùn)動及相互間的碰撞頻率，分子的劇烈運(yùn)動導(dǎo)致植物組織細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的破壞，更有助于有效成分的溶出。同時，短時間微波處理可以鈍化多酚氧化酶，防止酶促褐變[8]。

2.1.5 微波處理時間對提取效果的影響

微波處理時間對提取效果的影響，見圖5。

從圖5中可以看出，微波處理時間超過120 s，提取率不增加反而下降。這可能是微波處理時間過長，溫度上升迅速，荷葉黃酮化合物部分分解所致。

2.1.6 正交試驗(yàn)確定最佳提取工藝

利用正交設(shè)計(jì)助手IIV3.1設(shè)計(jì)不同提取條件對提取效果的正交試驗(yàn)。選擇不同的乙醇濃度、料液比、超聲波處理時間、微波功率和微波處理時間，以提取率作為考察指標(biāo)見表1。

提取的最佳工藝條件為乙醇濃度60%、料液比0.04 g/mL（1∶25）、超聲提取時間25 min、微波功率462 W、微波提取時間90 s（均值最大），該組合在已經(jīng)進(jìn)行的16組試驗(yàn)中沒有出現(xiàn)。通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，在乙醇濃度60%、料液比0.04 g/mL（1∶25）、超聲提取時間25 min、微波功率462 W、微波提取時間90 s的條件下，荷葉黃酮提取率為2.45%。對表1的結(jié)果進(jìn)行方差分析得到表2。可知，表明各因素對黃酮提取效果的影響依次為:乙醇濃度>微波功率>微波處理時間>料液比>超聲波處理時間（F比依次減小）。各因素對黃酮提取效果的影響均未達(dá)到顯著（P＜0.05）。

2.2 荷葉黃酮清除羥自由基和超氧陰離子自由基

引起生物系統(tǒng)損傷的自由基主要是羥自由基，并且一旦形成，羥自由基便由最初的鏈反應(yīng)增加氧化損傷的能力。超氧陰離子自由基存在壽命長，可以從其生成位置擴(kuò)散到較遠(yuǎn)的距離，達(dá)到靶位置，從而對生物體具有較大的危害性[12]。

表 1 不同提取條件正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果Table 1 Orthogonal tests and results of extraction

表 2 不同提取效果的方差分析表Table 2 Variance analysis of extraction

荷葉黃酮對羥自由基和超氧陰離子自由基具有一定的清除作用。隨著黃酮提取液濃度的增加，對羥自由基和超氧陰離子自由基的清除能力增強(qiáng)；但當(dāng)提取液達(dá)到一定濃度，荷葉黃酮對自由基的清除作用減弱，趨于平緩。從反應(yīng)動力學(xué)曲線上可以看出，黃酮為125 mg/L（以蘆丁計(jì)）時，可以清除50%的羥自由基（EC50，圖6），黃酮為3.5 mg/L（以蘆丁計(jì)）時，可以清除50%的超氧陰離子自由基（EC50，圖7）。

3 結(jié)論

荷葉中含有豐富的黃酮。超聲波與微波復(fù)合法可以提取更多的荷葉黃酮類化合物，最佳提取條件為乙醇濃度60%、料液比1∶25、超聲提取時間25 min、微波功率462 W、微波提取時間90s，荷葉黃酮提取率為2.45%。

荷葉黃酮具有較強(qiáng)的清除羥自由基、超氧陰離子自由基的作用。在荷葉黃酮分別為125 mg/L和3.5 mg/L（以蘆丁計(jì)）時，可以清除50%的羥自由基和超氧陰離子自由基。

荷葉是一種價格低廉，功效顯著的天然原料，可開發(fā)制成保健袋泡茶、保健酒、軟飲料等保健食品，研究其功能成分的提取以及功能作用對于荷葉保健食品的開發(fā)具有一定的指導(dǎo)意義。

參考文獻(xiàn)：

[1]杜力軍,孫虹,李敏,等.荷葉大豆及其合劑調(diào)脂活性部位的研究[J].中草藥,2000,31(7)：526-528

[2]陶波,陳慕英,李曉寧,等.荷葉藥用研究概況[J].中醫(yī)藥信息,2001,18(2):14

[3]StadtmanER.Proteinoxidationandaging[J].Science,1992,257(5074):1220-1224

[4]金輝,趙亞平,于文利,等.兩種天然抗氧劑清除活性氧的研究[J].食品工業(yè)科技,2001,22(2):25-27

[5]Morenno S C,Larrauri J A,Calixto S F.A procedure to measure the antiradical efficiency of polyphenols[J].Journal of the science of food and agriculture,1998,76(2):270-276

[6]房喻.黃芩甙及其銅(Ⅱ)、鋅(Ⅱ)配合物對超氧自由基的清除作用[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報,1991,7(6):753-756

[7]靳素榮,徐望,雷家珩,等.超聲提取荷葉黃酮的工藝研究[J].食品科技,2007,32(10):97-99

[8]蔡為榮.微波提取荷葉黃酮及其清除羥基自由基的研究[J].食品科學(xué),2004,25(9):112-115

[9]Qian J Y,Liu D,Huang A G.The efficiency of flavonoids in polar extracts of Lycium chinense Mill fruits as free radical scavenger[J].Food chemistry,2004,87(2):283-288

[10]徐向榮,王文華,李華斌.熒光法測定Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基[J].分析化學(xué),1998,26(12):1460-1463

[11]保志娟,丁中濤,曹秋娥,等.蘆丁-鍺配合物及其自由基清除活性研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2005,17(3):263-266

[12]張立偉,王金山,江崇球.超臨界流體CO2萃取中藥有效成分的抗氧化性的分光光度法研究 [J].光譜學(xué)與光譜分析,2004,24(9):1103

Study on Flavonoids Composite Extraction from Lotus Leaf and its Radicals Scavenging Capacity

JIN De-kuan，SUN Zhi-yang
（Jiangsu Food Science College，Huai'an 223003，Jiangsu，China）

Lotus leaf flavonoids were extracted by ultrasonic and microwave.The optimal process conditions for flavonoids extraction was obtained to extract 25 minutes with 60%alcohol when solid－to－liquid ratio was 1∶25 by ultrasonic.And then extracts were extracted 90 seconds when power was 462－watt by microwave.Extraction yield of flavones was 2.45%.Flavonoids activities to scavenge hydroxy radicals and superoxide radicals were examined.When flavonoids（rutin as reference substance）were 125 mg/L and 3.5 mg/L，50%hydroxy radicals and superoxide radicals were scavenged.The results showed that lotus leaf flavonoids has hydroxy radicals and superoxide radicals scavenging capacity.It provides a theoretical basis for Lotus leaf as natural antioxidant.

lotus leaf；flavonoids；extraction；radicals

淮安市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（HAG20100044）

金德寬（1955—），男（漢），副教授，本科，主要從事食品分析與檢測教學(xué)與研究工作。

2011-05-01