大孔吸附樹脂對類胡蘿卜素的靜態吸附研究

劉卉琳，劉紹，2，蘭時樂，謝達平，*

（1.湖南農業大學生物安全與技術學院，湖南 長沙 410128；2.湖南農業大學食品科技學院，湖南 長沙 410128；3.湖南農業大學生命科學技術學院，湖南 長沙 410128）

大孔吸附樹脂對類胡蘿卜素的靜態吸附研究

劉卉琳1，劉紹1，2，蘭時樂3，謝達平3，*

（1.湖南農業大學生物安全與技術學院，湖南 長沙 410128；2.湖南農業大學食品科技學院，湖南 長沙 410128；3.湖南農業大學生命科學技術學院，湖南 長沙 410128）

為尋找大孔吸附樹脂對粘性紅圓酵母產類胡蘿卜素的最佳純化條件，比較了6種大孔吸附樹脂對類胡蘿卜素的靜態吸附能力，并對所選擇樹脂的吸附最佳條件和解吸條件進行了研究。結果表明，DS-401型大孔吸附樹脂具有最佳的吸附和洗脫參數，其最佳工藝為在pH為6.0、溫度為25℃、時間為1 h的條件下吸附率最大，可達80.58%，此時選用100%石油醚做解吸劑，于30℃解吸1 h，解吸率最大，可達95.32%。

類胡蘿卜素；大孔吸附樹脂；吸附；解吸

隨著類胡蘿卜素在人們生活、醫療、保健上的作用日益受到關注，隨著天然類胡蘿卜素用量的不斷增加，開發利用天然類胡蘿卜素資源已是大勢所趨。

本文在前期類胡蘿卜素的微生物合成研究基礎上，研究了大孔吸附樹脂對粘性紅圓酵母發酵生產的類胡蘿卜素的吸附解吸特性，以篩選出適合純化類胡蘿卜素的大孔吸附樹脂，為類胡蘿卜素分離純化奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種：粘性紅圓酵母（Rhodotorula mucilaginosa）b－5（湖南農業大學生物科技學院微生物實驗室保藏）。斜面培養基：PDA培養基。液體種子培養基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母膏1%，pH6.0。液體發酵培養基：3.2%葡萄糖，1.8%NH4NO3，0.2%酵母膏，0.03%MgSO4·7H2O，0.1%KH2PO4。β-胡蘿卜素對照品：購自天津藥典標準儀器藥品有限公司；大孔吸附樹脂：AB－8和X－5購于南開大學化工廠；D－101和DS－401：購于天津市海光化工有限公司；HP20：購于日本三菱化工；HPD400：購于滄州寶恩化工有限公司。恒溫搖床（SYC－L）：上海聯歡生物工程設備有限公司；可見分光光度計（VIS－723N）：北京瑞利分析儀器有限公司；數顯恒溫水浴鍋（HH－4）：上海浦東物理光學儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 標準曲線的繪制

準確稱取一定量的β-胡蘿卜素對照品，用少量三氯甲烷溶解后，再用石油醚定容，配制成質量濃度為0.01 mg/mL的溶液。精密吸取對照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 于7只10 mL 容量瓶中，加入石油醚定容，搖勻，于450 nm處測定其吸光度。以溶液質量濃度C為橫坐標，吸光度A為縱坐標，得標準曲線：y=0.2875x+0.0039，R2=0.9993。

1.2.2 類胡蘿卜素的微生物發酵

挑取活化好的粘性紅圓酵母菌株，接種于種子培養基上（裝液量為30 mL/250 mL三角瓶），28℃下180 r/min振蕩培養2 d，以此作為種子液。吸取種子液2.5mL接種于液體發酵培養基中（裝液量為50mL/250 mL三角瓶），28℃下180 r/min振蕩培養3 d，即得含類胡蘿卜素的發酵液。

1.2.3 類胡蘿卜素的提取

取發酵液10 mL于3500 r/min下離心15 min，沉淀即為濕菌體，在其中直接加入10 mL 3 mol/L鹽酸，于28℃下振蕩浸泡1 h，然后置入沸水浴中保持4 min，再迅速冷卻，于3500 r/min離心15 min，棄上清液，沉淀以蒸餾水洗滌3次后加入10 mL丙酮，28℃下振蕩浸泡2 h，然后3500 r/min離心15 min。上清液即為類胡蘿卜素的提取液[3]。

1.2.4 樹脂的預處理

各種大孔吸附樹脂以95%的乙醇溶液浸泡24 h后，用蒸餾水洗至中性，于2%HCl溶液中浸泡12 h，然后用蒸餾水洗至中性，再以2%NaOH溶液浸泡12 h，最后用蒸餾水洗至中性，濕法保存備用。

1.2.5 靜態吸附試驗

1.2.5.1 大孔吸附樹脂的選擇

準確稱取預處理好并用濾紙充分吸干水分的AB-8，X-5，D-101，DS-401，HP20和HPD400樹脂各1.0 g于棕色具塞瓶中，每瓶中精密量取10 mL色素提取液，吸附30 min，用723型可見分光光度計于450 nm處測定吸附前和吸附后的吸光度，計算各樹脂對類胡蘿卜素的吸附率。吸附率/%=（吸附前吸光度×吸附液體積－吸附后吸光度×吸附液體積）/（吸附前吸光度×吸附液體積）。

1.2.5.2 樹脂的靜態動力吸附試驗

準確稱取預處理好并用濾紙充分吸干水分的X-5和DS-401樹脂1.0 g，分別置于棕色具塞瓶中，每瓶中精密量取10 mL色素提取液，置于20℃的恒溫水浴搖床上，每隔15 min取樣于450 nm處測定吸光度，吸附2 h，計算樹脂的吸附率，并繪制靜態吸附動力學曲線。

1.2.5.3 pH的選擇

準確稱取預處理好并以濾紙充分吸干水分的6份DS-401樹脂各1.0 g于棕色具塞瓶中，每瓶中精密量取10 mL色素提取液，分別調節pH為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0和7.0，置于20℃的恒溫水浴搖床上，吸附1 h后，于450 nm處測定吸光度，計算不同pH下DS-401樹脂對類胡蘿卜色素的吸附率。

1.2.5.4 溫度的選擇

準確稱取預處理好并以濾紙充分吸干水分的6份DS-401樹脂各1.0 g于棕色具塞瓶中，每瓶中精密量取10 mL色素提取液，調pH為6.0，分別將具塞瓶置于10、15、20、25、30、35 ℃的恒溫水浴搖床上，吸附1 h后，于450 nm處測定吸光度，計算不同溫度下DS-401樹脂對類胡蘿卜色素的吸附率，并比較其大小。

1.2.6 靜態解吸試驗

1.2.6.1 洗脫液的選擇[4]

取1.0 g吸附好類胡蘿卜素的DS-401樹脂6份，分別加入石油醚、乙醚、丙酮、己烷、乙酸乙酯、四氫呋喃洗脫劑各10 mL，室溫下解吸1 h后，取上清液，于450 nm處測定吸光度，根據樹脂的吸附量計算解吸率[5]。

式中：Q為吸附量，（mg/g）；D為解吸率，%；C0起始濃度，（mg/mL）；C1為吸附后剩余液濃度，（mg/mL）；V為溶液體積，mL；W為干樹脂重量，g；C2為解吸液濃度，（mg/mL）；V2為解吸液體積，mL。

1.2.6.2 洗脫液比例的選擇

取1.0 g吸附好類胡蘿卜素的DS-401樹脂6份，按照不同比例（見表1）分別加入石油醚和乙醚共10 mL，室溫下解吸1 h后，取上清液，于450 nm處測定吸光度，根據樹脂的吸附量計算解吸率。

表 1 石油醚與乙醚不同含量Table 1 The content of the petroleum ether and aether

1.2.6.3 洗脫溫度和時間的選擇

取1.0 g吸附好類胡蘿卜素的DS-401樹脂5份，加入石油醚10 mL，分別放于10、15、20、25、30 ℃的恒溫水浴鍋內，每隔15 min取上清液，于450 nm處測定吸光度，解吸2 h后，根據樹脂的吸附量計算解吸率。

2 結果與分析

2.1 不同樹脂吸附率比較結果

6種大孔吸附樹脂對類胡蘿卜素的吸附情況如圖1所示。

由圖1可知，X-5和DS-401樹脂對類胡蘿卜素的吸附率較高，可通過對其靜態吸附動力學的研究，進一步篩選最佳樹脂。

2.2 樹脂的靜態吸附動力學曲線

樹脂的靜態吸附動力學曲線，見圖2。

由圖2可以看出，2種吸附樹脂在吸附60 min時，樹脂的吸附率達到最大，隨著時間繼續延長，吸附率不但沒有增大，反而減少，這可能是由于類胡蘿卜素與空氣接觸被氧化的結果。因此，采用1 h作為吸附時間。在1 h內DS-401樹脂的吸附率始終高于X-5，最終確定選用DS-401樹脂進行靜態的吸附和解吸試驗。

2.3 pH對吸附率的影響

DS-401樹脂對不同pH的樣品溶液中類胡蘿卜素的吸附情況，見圖3。

由圖3可知，當pH為1.0至6.0時，樹脂的吸附率呈逐漸升高趨勢，且當pH為6.0時，樹脂的吸附率最大，此后，隨著pH的增加，吸附率降低。這可能是由于該類胡蘿卜素內含有一定量的羧基（-COOH），呈現一定的酸性，因此在微酸性條件下易被樹脂吸附。這與報道中紅酵母紅素（圖4）的結構式相符[6-7]。

2.4 不同溫度對吸附率的影響

在不同吸附溫度下，DS-401樹脂對pH為6.0的類胡蘿卜素溶液的吸附情況，見圖5。

由圖5可知，當溫度從10℃上升至35℃，樹脂的吸附率呈現先逐漸升高后降低的趨勢，當溫度為25℃時，樹脂的吸附率最大，可達80.58%。由于類胡蘿卜素的熱穩定性不高，所以選擇的吸附溫度不宜過高，而溫度過低，由于吸附反應速度太慢，往往在短時間內達不到平衡。因此，最佳吸附溫度確定為25℃。

2.5 不同洗脫液的解吸率比較結果

不同洗脫液的解吸率比較結果，見圖6。

從圖6可以看出，選用了6種不同的洗脫液對吸附好的DS-401樹脂進行洗脫，石油醚和乙醚的洗脫效果較其他洗脫液的效果好。因此，選用石油醚和乙醚進行洗脫實驗。

2.6 不同石油醚與乙醚的配比對解吸率的影響

2種不同洗脫液對解吸效果的影響，見圖7。

由圖7可以看出，隨著乙醚的用量逐漸減少，石油醚的用量逐漸增多，解吸效果呈現先下降后升高的趨勢，說明2種洗脫液分別解吸的效果優于混合的效果，而100%石油醚的效果最好。因此，選用石油醚作為洗脫液。

2.7 不同溫度和時間對解吸率的影響

不同溫度和時間對解吸率的影響，見圖8。

由圖8可以看出，隨著溫度的升高，類胡蘿卜素在樹脂上的吸附能力降低，解吸率逐漸增加；在溫度為10、15、20、25 ℃時，隨著時間的增加，解吸率呈增加趨勢，在解吸1 h后解吸率增加趨勢減緩；在溫度為30℃時，開始時隨著時間的增加，解吸率呈增加趨勢，直至解吸1 h時解吸率達最大值95.32%，隨后隨著時間繼續增加，解吸率降低后趨于穩定，說明該情況下解吸效果并不是時間越長越好。可見，本實驗條件下，于30℃解吸1 h對類胡蘿卜素的解吸效果最佳。

3 結論

靜態吸附試驗表明DS-401型大孔吸附樹脂是吸附粘性紅圓酵母產生的類胡蘿卜素效果較好的樹脂。進一步的靜態吸附和解吸試驗表明發酵提取液在溫度為25℃，pH為6.0，吸附1 h的條件下吸附率最大可達到80.58%。選用100%石油醚做洗脫劑，于30℃解吸1 h，解吸率最大，可達95.32%。大孔吸附樹脂價格低廉，可反復使用，現已廣泛用于天然植物中的活性成分，但對微生物產生的類胡蘿卜素的純化鮮見報道，研究具有相當的實用價值和指導意義。

[1]王歲樓.食品生物技術[M].北京:中國海洋出版社,1998：201-210

[2]Bhosale P B.Studies on Yeast Rhodotorula,Its Carotenoids And Their Applications[D].University of Pune,2001：48-56

[3]楊文.一種簡單的胞壁破碎方法[J].微生物學通報,1995,22(1):58-59

[4]張裕卿,張黎明,孟李,等.大孔吸附樹脂對番茄紅素和β-胡蘿卜素吸附分離的研究[J].中草藥，2002,33(7):602-604

[5]勵娜,楊榮平,張小梅,等.大孔樹脂分離山楂總黃酮工藝優化[J].中國中藥雜志,2007,32(13):1352-1355

[6]Méndez-Alvarez S,Rüfenacht K,Eggen R I.The oxidative stresssensitive yap1 null strain of saccharomyces cerevisiae becomes resistant due to increased carotenoid levels upon the introduction of the chlamydomonas reinhardtii cDNA,coding for the 60S ribosomal protein L10a[J].Biochemical and biophysical research communications，2000,267(27):953-959

[7]Razavi S H,Marc I.Effect of temperature and pH on the growth kinetics and carotenoid production by sporobolomyces ruberrimus H110 using technical glycerol as carbon source[J].Iran J Chem Chem Eng，2006,25(3):59-64

Study on the Static Adsorption for Purification of Carotenoid by Macroporous Resin

LIU Hui－lin1，LIU Shao1，2，LAN Shi－le3，XIE Da－ping3，*

（1.College of Bio－Safety Science＆ Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，Hunan，China；2.College of Food Science＆ Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，Hunan，China；3.College of Bio－Science ＆ Technology，Hunan Agricultural University，Changsha，410128，Hunan，China）

An optimal macroporous adsorption resin was chosen to purify the carotenoid produced by Rhodotorula mucilaginosa.And its conditions of static adsorption and desorption were studied in this paper.The result show that DS－401 resin was of excellent adsorption and desorption performance to carotenoid.The optimal adsorption condition was pH6.0，25 ℃ ，1 h，adsorption rate was up to 80.58% .The optimal desorption condition was 30℃，1 h while 100%petroleum ether was taken as the optimal eluent，the desorption rate was up to 95.32%.

carotenoid；macroporous adsorption resin；adsorption；desorption

*通信作者：謝達平（1945—），男，博士生導師，主要從事酶學理論與應用研究。中提取受制于季節，同時要求有比較高的下游處理技術，并且產量相對比較低，成本相當高。近年來，人們對微生物生產類胡蘿卜素進行了大量的研究。截止目前人類已經發現能夠產生類胡蘿卜素的微生物有真菌、細菌和藻類等。這些微生物中，紅酵母因其營養要求簡單，成本低，發酵周期短，含有豐富的蛋白質，菌體可綜合利用[2]，因此具有較大的應用價值和發展前景。

眾所周知，類胡蘿卜素在淬滅自由基、增強人體免疫力、促進細胞縫間聯接交流和減少慢性疾病等保護人類健康方面起著相當重要的作用。

一般來說，類胡蘿卜素主要通過化學合成法，植物提取法和微生物發酵法得到[1]。其中化學合成法副產物多，選擇性差，操作條件需高溫高壓，成本也高。從植物

劉卉琳（1983—），女（侗），在讀博士，研究方向：微生物工程與制劑方面。

2011-03-07