鮮豬肉中沙門氏菌生長預測模型的建立

高麗娟，甕紹蘇，劉清珺，張經華，陳爾凝，白羽，韓北忠

（1.北京市理化分析測試中心，北京，100089；2.中國農業大學食品科學與工程學院，北京 100083）

鮮豬肉中沙門氏菌生長預測模型的建立

高麗娟1，2，甕紹蘇1，劉清珺1，張經華1，陳爾凝1，白羽1，韓北忠2，*

（1.北京市理化分析測試中心，北京，100089；2.中國農業大學食品科學與工程學院，北京 100083）

以新鮮豬肉濾汁為培養液，接種沙門氏菌，繪制沙門氏菌在17、25、30、35、37℃下的生長曲線。一級模型分別使用Logistic和Baranyi模型擬合。二級模型以Ratkowsky方程為基礎，代入Baranyi模型擬合數據，描述了溫度對最大生長速率的影響。二級模型通過殘差圖、準確因子、偏差因子以及預測值與實測值對比圖進行了檢驗，結果顯示殘差在±0.05之間，準確因子為1.0464，偏差因子為0.9933，預測值與實測值比較接近。

沙門氏菌；生長模型；豬肉；Logistic模型；Baranyi模型；Ratkowsky模型

沙門氏菌引起的疾病是公共衛生學上具有重要意義的人畜共患病之一。沙門氏菌屬腸桿菌細菌科，兼性厭氧，包括鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌和腸炎沙門氏菌等[1]。鮮肉及肉制品營養豐富，有適合微生物生長的營養條件（包括碳源、氮源、水和無機鹽以及微量元素）、酸堿環境和一定的氧氣環境，絕對無菌是不存在的[2]，在我國,由于冷鏈系統不完善和控制措施不當，會使肉制品中的微生物在適宜的條件下大量繁殖,使其安全和品質不能得到有效的保證和監控,嚴重危害人們的健康[3]。在確定相關溫度、pH、水分活度、防腐劑等環境因素下，應用預測食品微生物學的數學模型，可以快速對重要微生物的生長、存活和死亡進行預測，從而確保食品在生產、運輸、儲存等過程中的安全和穩定，是一種防止病原微生物對食品污染的有效的預警工具[4]。

動力學模型是建立有關微生物生長速率和環境因素之間的數學模型[5]。Whiting和Buchanan[6]提出的模型分類系統將模型分為一級、二級和三級模型。一級模型是依據微生物的生長曲線，描述環境條件和食品成分等因素對微生物生長產生的影響[7]。二級模型主要表達初級模型的參數（λ、μ、A等）與環境變量（溫度、pH、Aw、氣體濃度等）之間的函數關系[8]。較為常用的有響應面方程（Response Surface Equation）、平方根模型（Square Root Model）、Arrhenius模型等。三級模型主要指建立在初級和二級模型之上的電腦應用軟件程序[9]。通過建立微生物的一級、二級生長模型，可以進一步建立如ComBase[9]，TFI[10]，HACCP[11]等三級模型軟件，從而有效指導食品生產、加工、運輸、儲存等步驟條件的控制，為食品安全提供保證。

1 材料與方法

1.1 菌株

沙門氏菌標準菌株CMCC 1.1552（Salmonella）購自中國藥品生物制品檢定所。

1.2 培養基與試劑

32號瓊脂培養基：牛肉浸膏（北京陸橋技術有限責任公司）5.0 g/L，蛋白胨（北京陸橋技術有限責任公司）10.0 g/L，酵母提取物（北京陸橋技術有限責任公司）5.0 g/L，葡萄糖（北京北化精細化學品有限責任公司）5.0 g/L，NaCl（北京北化精細化學品有限責任公司）5.0 g/L，瓊脂粉（日本kebio公司）15 g/L。實驗用培養液制備：將250 g市售冷鮮豬肉用滅菌剪刀剪成小塊后，放入無菌袋，加入滅菌生理鹽水500 mL，用均質器充分拍打、粉碎，得到的肉懸液依次通過80、40、0.45、0.22μm的無菌濾膜進行除菌，其濾液作為后續培養基備用。

1.3 儀器

ZSD-1270生化培養箱：上海智城分析儀器制造有限公司；HG-80高壓蒸汽滅菌鍋：HIRAYAMA MANUFACTURING CORPORATION；UW6200H電子天平、UV-1800紫外分光光度計：島津（香港）有限公司；B-212pH計：堀場貿易（上海）有限公司。

1.4 實驗方法

培養基的理化性質對微生物的生長有顯著影響[12]，本實驗使用鮮豬肉濾汁作為培養基，與實際豬肉中微生物生長環境較為接近。將豬肉濾汁培養基各100 mL分裝在5個錐形瓶中，分別放在17、25、30、35和37 ℃恒溫培養箱中預熱，使溫度達到平衡。用生理鹽水將活化好的沙門氏菌進行適當稀釋，用移液器吸取菌液1 mL加入預熱好的豬肉濾汁培養基中，使接種的沙門氏菌的初始濃度小于102cfu/mL，將5個錐形瓶放置于相應溫度的培養箱中。同時以未接種的豬肉濾汁培養基作為空白對照。每隔一定時間取出錐形瓶，混勻培養液后，取3個1 mL培養液用于測定吸光度。實驗所得數據代入一級模型建立生長動力模型。

1.5 模型的建立

1.5.1 一級模型

Baranyi模型[13-14]中加入了一個調整函數a（t）。a（t）取決于細胞的生理狀態和對新環境的適應，從而可以描述微生物生長的遲滯期。若前培養條件相同，細胞的最大生長速率μm和遲滯期λ的乘積只隨著細胞的生理狀態而改變。該模型的簡化形式為：

式中：t為任意時刻，h；N為t時刻的細菌數，（cfu/mL）；N0為初始菌數，（cfu/mL）；μm為最大生長速率，[（log cfu/（mL·h）]；λ為遲滯期，h。

同時應用經典的Logistic模型對生長曲線進行曲線擬合分析，與Baranyi模型進行比較。Logistic模型表達式為：

式中：A1，A2，x0，p為參數。

1.5.2 二級模型

Ratkowsky等[15-16]根據微生物在不同溫度條件下，生長速率或遲滯期倒數之間存在線性關系，提出一個經典的二級模型[17]：

式中：T為建模溫度，℃；TMIN，μ和TMIN，λ分別為對應于μm和λ的細菌最小生長溫度，℃；a，b為模型常數。

實驗中，Baranyi模型用DMfit veraion2.0軟件來擬合,Logistic模型用Origin8.0軟件來擬合，Ratkowsky模型使用Microsoft Excel 2007軟件擬合。

1.6 模型的檢驗

將計算得到的各溫度下沙門氏菌在鮮豬肉濾汁中的生長速率，與Ratkowsky二級模型的預測值相比較。繪制殘差圖，按（4）和（5）計算偏差因子（bias factor）與準確因子（accuracy factor），同時繪制預測值與實測值對比圖，對模型進行檢驗。

2 結果與分析

2.1 沙門氏菌一級生長模型的建立

使用Baranyi模型對沙門氏菌在17、25、30、35、37 ℃的生長曲線進行擬合，DMfit軟件同時還計算出了沙門氏菌生長模型的2個變量生長速率（μm）和遲滯期（λ），以及擬合曲線的相關系數（r2）和標準誤差（SE），如表1所示。

表 1 Baranyi模型參數及統計分析Table 1 Statistic analysis of growth parameters of Baranyi&Robert model

使用Logistic模型對沙門氏菌在17、25、30、35、37 ℃的生長曲線進行擬合，由Origin8.0軟件計算出擬合方程中的系數，如表2所示。

表 2 Logistic模型參數及統計分析Table 2 Statistic analysis of growth parameters of Logistic model

實驗結果表明，在本實驗條件下，使用Baranyi模型與Logistic模型擬合，均能得到較高的相關系數（R2≥0.97），選擇Baranyi模型得出的參數進一步建立二級模型。

2.2 沙門氏菌二級生長模型的建立

將不同溫度下Baranyi模型擬合得出的最大生長速率μm代入Ratkowsky方程擬合，即得到最大生長速率-溫度的二級模型，擬合曲線見圖1。

得到的擬合方程為：

式中，T（溫度）、μm（最大生長速率）的單位分別為℃、[log cfu/（mL·h）]。

從圖1中可以看出，溫度在5℃～37℃范圍內沙門氏菌的比生長速率的平方根與溫度呈線性關系，并且生長速率隨著溫度的升高而增加，擬合方程的相關系數（r2）達到了0.9429。

2.3 模型的檢驗

對沙門氏菌生長速率模型的準確性在實驗室條件下用以下3種方法進行了檢驗。

2.3.1 殘差檢驗

從圖2可知，沙門氏菌生長速率平方根的殘差均在±0.05范圍內，因此可以認為該模型在α=0.05水平上是可信的。

2.3.2 準確因子與偏差因子檢驗

用國際上通用的2個指標偏差因子和準確因子對本實驗所得預測模型進行了檢驗。偏差因子是衡量預測值是否高過或低于實測值，該值小于1表明生長速率值比實測值大，預測值較為安全；大于1表示生長速率預測值比實測值小。準確因子表示預測值與實測值的相對標準偏差，該值等于1表明預測值與實測值完全吻合。本實驗建立的模型經檢驗，準確因子為1.0464，偏差因子為0.9933，說明預測結果較為準確，該模型可以被接受。

2.3.3 實測值與預測值對比

通過沙門氏菌生長的實測值與預測值進行對比，來檢驗模型的準確性，結果如圖3所示。

3 結論

本實驗以新鮮豬肉濾汁為培養液，接種沙門氏菌，應用Baranyi模型和Logistic模型擬合了沙門氏菌一級模型生長曲線，得出其在17、25、30、35、37 ℃均有較高的相關系數（R2≥0.97）。將Baranyi模型計算得到的最大生長速率數據，帶入Ratkowsky方程擬合得到溫度-最大生長速率的二級模型,擬合方程的相關系數（r2）達到了0.9429。通過繪制殘差圖、準確因子、偏差因子以及觀測值與實測值對比圖進行模型檢驗。結果殘差在±0.05之間，準確因子為1.0464，偏差因子為0.9933，預測值與實測值比較接近。

傳統的一級模型建立，常使用商品化的培養基或直接使用豬肉切片作為培養基。然而，商品化的培養基其化學組成與實際豬肉有一定差距；直接使用豬肉切片，由于存在天然菌群的干擾，導致不同豬肉樣品間存在較大差異，實驗重復性較低。本文使用鮮豬肉濾汁作為培養基，與商品化培養基相比較，其成分更接近真實豬肉，同時濾汁經過過濾除菌，有效地控制了實驗中的變量，簡化了模型設計。

[1]Le Minor.GenusⅢ Salmonella in Noel R.[M]//Kring，John G.Holt Ed Bergey's manual of systematic bacteriology（Volume1）,London:Willams&Wilkines,Baltimore,1994:427-458

[2]伍良軍.超高溫滅菌奶微生物污染的質量控制[J].中國乳業，2004(7):51-52

[3]李苗云,朱應舉,趙改名.微生物預測模型研究及其在肉品工業中的應用[J].食品科技，2008(2):57-59

[4]董明盛，賈英民.食品微生物學[M].北京：中國輕工業出版社，2006：340-342

[5]郭全友,錢志偉.預測微生物學在食品品質和安全評估上的運用[J].海洋漁業,2003,25(3):158-160

[6]趙志晶，劉秀梅.食品微生物危險性評估[J].中國食品衛生雜志，2003,15(4):341-345

[7]李波，李里特，辰已英三.預測微生物學的研究進展[J].食品與發酵工業，2001,27(11):54-57

[8]韓北忠，李敏，張琳，等.預測微生物學與食品質量安全[J].中國釀造，2005(9):1-3

[9]周康,劉壽春,李平蘭.食品微生物生長預測模型研究新進展[J].微生物學通報,2008,35(4):589-594

[10]MeMeeking T A,Ross T.Application of predictive microbiology to assure the quality and safety of fish and fish products[J].Int J Food microbial,1992,15(1/2):13-32

[11]Neil H Armitage.Use of predictive microbiology in meat hygiene regulatory activity[J].Int J Food Microbiol,1997,36(2/3):103-109

[12]Songamnat Pongsomboon,Sarote Sirisansaneeyakul,Ken Sasaki，et al.Development of the model to predict the growth of Salmonella spp in stirred fried rice with crab meat[J].Songklanakarin J Sci Technol,2007,29(4):1115-1121

[13]Baranyi J,Roberts T A,McClure P A.Non-autonomous differential equation to model bacterial growth[J].Food Microbiology,1993,10(1):43-59

[14]Baranyi J,Roberts T A.A dynamic approach in predicting bacterial growth in food[J].International Journal of Food Microbiology,1994,23(3/4):277-294

[15]郭劍飛，李柏林，歐杰.預測微生物學數學建模的方法構建[J].食品科學，2004，25(11)：53-57

[16]Ratkowsky D A,Olley J,McMeekin T A,et al.Relationship between temperature and growth rate of bacterial culture[J].Bacterial,1982，149(1):1-5

[17]Ayerst G.The Effects of Moisture and temperature on growth and spore germination in some fungi[J].Journal of Storedproducts Research,1969,5(2):127-141

Predictive Models for Salmonella Growth in Fresh Pork

GAO Li－juan1，2，WENG Shao－su1，LIU Qing－jun1，ZHANG Jing－hua1，CHEN Er－ning1，BAI Yu1，HAN Bei－zhong2，*
（1.Beijing Centre for Physical and Chemical Analysis，Beijing 100089，China；2.College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China）

Pork filtration，as a growth medium，was inoculated with Salmonella spp.to develop the growth curve of Salmonella at 17，25，30，35，37 ℃，respectively.Primary models were developed based on Baranyi model and Logistic model，respectively.The secondary model was developed based on the Ratkowsky model for the effect of different temperatures on the maximum growth rate.The secondary model was validated through residual plots，bias factor，accuracy factor，and plot of predictive versus observed data.The result of the validation indicated that the residual was±0.05，the bias factor and the accuracy factor was 1.0464 and 0.9933，respectively，and the predictive data was close to the observed data.

Salmonella；growth model；pork；Logistic model；Baranyi model；Ratkowsky model

北京市科技新星計劃資助項目（2008B31）

高麗娟（1978—），女（漢），副研究員，博士，研究方向：應用微生物學。

*通信作者：韓北忠（1961—），男，教授，博士，研究方向：食品微生物學。

2011-07-01