里氏木霉與黑曲霉糖化油茶粕的研究

彭玲，熊筱娟

（江西省天然藥物活性成分研究重點實驗室，宜春學院化學與生物工程學院，江西 宜春 336000）

里氏木霉與黑曲霉糖化油茶粕的研究

彭玲，熊筱娟

（江西省天然藥物活性成分研究重點實驗室，宜春學院化學與生物工程學院，江西 宜春 336000）

對里氏木霉和黑曲霉組成混合菌糖化油茶粕進行研究。以油茶粕為主要原料，采用正交試驗對里氏木霉和黑曲霉混合菌糖化條件進行優化。最優糖化條件：糖化溫度為18℃，糖化時間為15 d，接種比例為2∶1（里氏木霉∶黑曲霉），接種量為6.4 mL/g，此條件下，還原糖得率為50.8%。

油茶粕；黑曲霉；里氏木霉；糖化

油茶作為我國南方丘陵地區的一種油料性植物，具有茶籽產量高、分布廣、品種多的優點。油茶籽榨取茶油后剩下的茶油粕中含有大量的蛋白質、脂肪、纖維素和糖，能為微生物的生長提供豐富的營養源，油茶粕作為纖維素乙醇發酵的原料具有得天獨厚的優勢。因此利用油茶粕生產燃料乙醇不僅能夠實現廢物利用，同時又為推動燃料乙醇在我國的發展，緩解我國能源危機及發展可再生清潔能源提供了一條新的途徑。

根據研究得知，里氏木霉產纖維素酶能力強，組分比較齊全，酶活較穩定，但是它所產的β-葡萄糖苷酶的活力比較低，分解纖維二糖的能力不夠強[1]。黑曲霉是優良的β-葡萄糖苷酶生產菌株，通過使用里氏木霉和黑曲霉共同培養、協同發酵，可以有效地緩解降解纖維素過程中因纖維二糖的積累而產生的反饋抑制[2-3]。采用黑曲霉與里氏木霉組成的混合菌進行油茶粕的糖化，產生大量可發酵糖，從而使后續油茶粕發酵產乙醇成為可能[4]。

本文報告以油茶粕為原料，以里氏木霉和黑曲霉為混合糖化菌，采用正交交互試驗確定里氏木霉和黑曲霉混菌糖化油茶粕的最優條件，為進一步發酵產生乙醇奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種：黑曲霉（購于廣東省微生物菌種保藏中心）；里氏木霉（購于廣州省微生物菌種保藏中心）。

原料：油茶粕（江西省青龍集團科技有限公司提供）。

培養基：PDA固體（液體）培養基。

試劑：無水乙醇，葡萄糖，磷酸氫二鈉，檸檬酸，羧甲基纖維素鈉，鹽酸，氫氧化鈉，酒石酸鉀鈉，3，5—二硝基水楊酸，苯酚，無水亞硫酸鈉等均為分析純試劑。

1.2 儀器與設備

250B生化培養箱：國華企業；超凈工作臺：蘇凈集團安泰公司；高速中藥粉碎機：長沙市岳麓區中南制藥機械廠；新世紀紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程[5]

1.3.2 操作要點[6]

采用油茶粕為原料，對其進行預處理（70%乙醇、液固比6∶1（mL/g）、70 ℃、超聲波振蕩處理6 h）以去除所含的皂素，然后經過洗凈、烘干等處理，稱取50 g原料，將經過拮抗實驗、菌種活化和擴大培養的里氏木霉與黑曲霉，按照一定比例，接種到油茶粕當中，放入生化培養箱中進行糖化，經過一段時間后，對糖化后的油茶粕進行高溫滅菌（121℃，30 min），離心過濾，在紫外分光度儀中對濾液進行還原糖測定。

1.3.3 還原糖測定[7]

采用3，5－二硝基水楊酸（DNS）法。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線繪制

2.2 黑曲霉與里氏木霉拮抗實驗

在無菌操作臺上，經高壓滅菌PDA培養基趁熱倒入培養平板中，冷卻至室溫，編號，A號培養皿中間接種里氏木霉，B號培養皿中間接種黑曲霉，C號培養皿相隔一定距離接種黑曲霉和里氏木霉，在28℃培養箱中培養2 d，實驗結果見圖2。

由圖2-A、圖2-B可知，里氏木霉和黑曲霉在PDA培養基上生長狀態良好。由圖2-C可以明顯可看出2種菌絲相互交接，由此說明里氏木霉與黑曲霉不存在拮抗作用。里氏木霉與黑曲霉產生酶系存在協同關系，2種菌種混合發酵可以減少底物的抑制作用，且微生物可以保持良好產酶狀態。

2.3 里氏木霉與黑曲霉協同糖化正交試驗

2.3.1 試驗設計

為了優化里氏木霉與黑曲霉協同糖化油茶粕的工藝參數，選擇糖化時間、糖化溫度、接種比例、接種量4個對糖化過程影響較大的因素設計L9（34）四因素三水平正交試驗，因素水平如表1所示。

表 1 因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

2.3.2 正交試驗結果與分析

正交試驗結果見表2。

表 2 正交試驗結果L9（34）Table 2 Results of orthogonal test L9（34）

2.3.2.1 糖化時間的選擇

從還原糖的正交試驗結果看出，糖化的時間對油茶粕的還原糖得率影響最大。糖化時間越長，還原糖得率越高，可能的原因是由于油茶粕原料中殘留的茶皂素具有毒性，影響微生物的生長、繁殖，微生物需要比較長的時間適應，才能產生足夠量的糖化酶、纖維素酶等。所以在工藝中要考慮盡可能的延長時間。所以最佳的糖化時間是15 d。

2.3.2.2 糖化溫度的選擇

就油茶粕的還原糖得率而言，正交試驗中糖化溫度是第二大影響因素。溫度的變化影響微生物的生長、繁殖和糖化力，所以最佳糖化溫度是18℃。

2.3.2.3 接種量的選擇

接種量的選擇從正交試驗結果中可以看出，試驗范圍內接種量越大越好，可能的原因是微生物接種量越多，產生越多發酵所需纖維素酶量，越能縮短發酵時間。所以最佳接種量為6.4 mL/g。

2.3.2.4 接種比例的選擇

里氏木霉：黑曲霉的接種比例的選擇對還原糖得率影響最小，可能的原因是里氏木霉和黑曲霉能夠很好地協同糖化油茶粕，所以最佳接種比例為2∶1（里氏木霉：黑曲霉）。

綜上，并結合糖化實際，確定最佳糖化工藝為：A3B1D3C2，即糖化最佳時間為15d、最適糖化溫度為18℃、接種量為6.4 mL/g、里氏木霉和黑曲霉最佳接種比例為2∶1。由極差分析可知，糖化條件因素的影響主次順序為A＞B＞D＞C，即糖化時間＞糖化溫度＞接種量＞接種比例。在該條件下，油茶粕經過糖化后，還原糖的產量可達到50.8%。

3 結論

1）以油茶粕為原料，利用微生物進行糖化發酵的試驗未見報道，本文對油茶粕進行糖化取得成功。

2）本文采用混合菌種里氏木霉和黑曲霉。黑曲霉和里氏木霉產生纖維酶是胞外酶，能更緊密與油茶粕結合，分解纖維素。里氏木霉酶系比較全，但里氏木霉所產生β-葡萄糖苷酶活性比較低，而黑曲霉所產生的β-葡萄糖苷酶活性比較高，所以里氏木霉與黑曲霉混合發酵，相互協同，可以提高纖維酶酶活性。黑曲霉與里氏木霉共生，不僅有益于酶系的改善，而且黑曲霉的生長繁殖消耗了纖維素酶促水解所生成的葡萄糖等，有益于纖維素酶的合成，提出了原料的利用價值。本文利用混合菌種里氏木霉和黑曲霉進行油茶粕糖化研究，是為后續糖化油茶粕生物發酵乙醇實驗奠定物質基礎。

3）通過正交試驗，得出里氏木霉和黑曲霉糖化油茶粕的最佳工藝條件是：糖化最佳時間為15 d、最適糖化溫度為18℃、接種量為6.4 mL/g、里氏木霉和黑曲霉最佳接種比例為2∶1，并且在此條件下，還原糖的產量可達到50.8%。

[1]王成華,孫納新,王健鵬,等.里氏木霉91-3纖維素菜酶產生條件的研究[J].食品與發酵工業,1996,12(5):1-52

[2]高浩,湯烈貴.纖維素科學[M].北京:科學出版社,1996：186-129

[3]黃秀梨.微生物學[M].北京:高等教育出版社,1999:23-78

[4]錢伯章.燃料乙醇的發展現狀和趨勢[J].節能與環保,2006,25(6):17-19

[5]宋安東,任天寶,謝慧,等.化學預處理對玉米秸稈酶解化效果的影響[J].化學與生物工程,2006,23(8):31-33

[6]張繼朱,王瑞明,關鳳梅,等.玉米秸稈水解液生產燃料酒精的研究[J].西部糧油科技,2003,22(5):63-65

[7]Cristobal Cara,Encarnacion Ruiz,Mercedes Ballesteros,et al.Production of fuel ethanol from steam-exposion pretreated olive tree pruning[J].Fuel,2008,87(6):692-700

Study on Saccharification Conditions Optimization of Aspergillus Niger and Trichoderma Reesei for Camellia Meal

PENG Ling，XIONG Xiao-juan
（Key Laboratory of Natural Medicinal Chemistry，Yichun University College of Chemistry and Bioengineering，Yichun 336000，Jiangxi，China）

To investigate saccharification of Aspergillus niger and Trichoderma reesei on Camellia meal.Using Camellia meal as raw materials，Saccharification Conditions were optimized by orthogonal test.The optimum conditions are saccharification temperature 18 ℃，saccharification time 15 days，inoculation proportion 2∶1，inoculation amount 6.4 mL/g，at this conditions，the yield is 50.8%.

camellia meal；Trichoderma reesei；Aspergillus niger；saccharification

江西省支撐計劃項目（2009BNB05600）

彭玲（1981—），女（漢），講師，碩士，研究方向：食品生物技術。

2011-03-20