多聚谷氨酸發(fā)酵的響應面法優(yōu)化

王輝，董超，史延茂，馬躍華，張聰莎，楊明

（1.河北工業(yè)大學化工學院生物工程系，天津 300130；2.河北省科學院生物研究所，河北 石家莊 050081；3.石藥集團維生藥業(yè)有限公司，河北 石家莊 050035）

多聚谷氨酸發(fā)酵的響應面法優(yōu)化

王輝1，董超2，*，史延茂2，馬躍華2，張聰莎2，楊明3

（1.河北工業(yè)大學化工學院生物工程系，天津 300130；2.河北省科學院生物研究所，河北 石家莊 050081；3.石藥集團維生藥業(yè)有限公司，河北 石家莊 050035）

以一株納豆芽孢桿菌進行多聚谷氨酸發(fā)酵，采用Plackett-Burman法對發(fā)酵工藝進行評價，得出培養(yǎng)基配方對多聚谷氨酸的產(chǎn)量有顯著影響的因子包括：葡萄糖、豆餅粉、谷氨酸鈉，然后用響應面法對這幾個因素進行優(yōu)化，所得的最佳培養(yǎng)基配方為：葡萄糖8%，豆餅粉3.2%，谷氨酸鈉4.8%，MgSO4·3H2O0.06%，CaCl20.06%，K2HPO4·3H2O0.39%，KH2PO40.3%，滅菌前pH 7.5，PGA產(chǎn)量由原來的15.4 g/L提高到26.2 g/L。

納豆芽孢桿菌；Plackett-Burman設計；響應面分析法；多聚谷氨酸

γ-PGA是一種由微生物發(fā)酵產(chǎn)生的氨基酸聚合物，由L-谷氨酸和D-谷氨酸通過酰胺鍵結合形成的一種多肽分子,具有水溶性、生物可降解性和生物相容性，適用于食品、化妝品、生物醫(yī)學、環(huán)境保護等領域[1-5]。多聚谷氨酸最早發(fā)現(xiàn)于1913年，存在于炭疽芽孢桿菌的莢膜中，而研究較多的是納豆芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的發(fā)酵過程[6-7]。特別是近年來隨著對γ-多聚谷氨酸的深入研究，γ-多聚谷氨酸作為一種高分子生物新產(chǎn)品,愈來愈顯現(xiàn)出廣闊的研究價值和應用前景。但是納豆的傳統(tǒng)固體發(fā)酵規(guī)模小且產(chǎn)率低，后處理比較復雜，所以一般采用液體深層發(fā)酵。我們保存的一株納豆芽孢桿菌，采用原來的經(jīng)驗培養(yǎng)基配方，多聚谷氨酸產(chǎn)量為15.4 g/L。

Plackett-Burman設計基于不完全平衡原理，采用最少的試驗次數(shù),從眾多的考察因素中快速而有效地篩選出主要的影響因子,為響應曲面法的進一步優(yōu)化提供主要影響因子。響應面分析法（response surface methodology，RSM）是能通過綜合試驗設計和數(shù)學建模得到準確有效結論的試驗設計方法,它以回歸法作為函數(shù)恒算工具，通過多項式近似，把因子與試驗結果（響應值）的關系函數(shù)化，因而試驗次數(shù)相對較少,試驗周期短,求得的回歸方程精度較高，2種方法的綜合使用可以減少的試驗次數(shù)達到試驗目標[8]。我們采用了響應面法，對該株納豆芽孢桿菌的PGA的液體發(fā)酵進行了優(yōu)化設計，改進后的培養(yǎng)基配方明顯提高了PGA的產(chǎn)量，達到了26.2 g/L，并且與試驗預期擬合較好，驗證了響應面法是一種可以優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)配方工藝的有效方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

納豆芽孢桿菌（Bacillus subtilis Natto）：河北省科學院生物所保存菌種；種子液體培養(yǎng)基（%）：蛋白胨1，牛肉浸膏 0.5，NaCl 0.5，滅菌前pH 7.2～7.3；發(fā)酵原始培養(yǎng)基（%）：葡萄糖4，豆餅粉0.75，KH2PO40.2，K2HPO4·3H2O 0.26，MgSO4·7H2O 0.04，CaCl20.04，滅菌前pH 7.5。

1.1.2 儀器

YJ-875型醫(yī)用超凈工作臺：蘇州凈化設備廠；7s-2102恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；MDZoo-3型電子天平：上海天平儀器廠；78HW-1型恒溫磁力攪拌器：杭州儀表電器廠；PXP-2顯微鏡：上海顯微儀器總廠；Universal32RhettiehZeufgen冷凍離心機：Genay。

1.2 菌種培養(yǎng)

1.2.1 菌種培養(yǎng)

挑取斜面種子接入裝有種子液體培養(yǎng)基的三角瓶中，裝量50 mL/250 mL，搖床培養(yǎng)，溫度33℃，轉速為200 r/min，培養(yǎng)時間12 h～15 h，為種子培養(yǎng)液。

1.2.2 PGA發(fā)酵培養(yǎng)

將種子培養(yǎng)液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量5%，溫度33℃，轉速200 r/min搖床培養(yǎng)，按設計方案進行試驗。

1.3 PGA的測定方法

發(fā)酵液離心（8000 r/min，10 min）去菌體取上清，取20 mL上清液，加入4倍體積的乙醇，沉淀4 h～6 h，離心（8000 r/min，10 min）取沉淀，放入烘箱中干燥，得粗多聚谷氨酸，稱重[9-11]。

1.4 納豆芽孢桿菌產(chǎn)PGA的發(fā)酵時間曲線

在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，每6 h取樣一次，對其pH，產(chǎn)量進行測定,確定產(chǎn)PGA的發(fā)酵過程。

1.5 Plackett-Burman篩選影響PGA產(chǎn)量的發(fā)酵因子

試驗單因子主要包括:碳源、氮源、谷氨酸鈉、KH2PO4、K2HPO4·3H2O、CaCl2、MgSO4、pH、溫度以及培養(yǎng)時間，接種量等。Plackett-Burman試驗在不丟掉主要信息的前提下，大大減少試驗次數(shù)，且根據(jù)試驗數(shù)據(jù)能有效地確定下一步的試驗方向與主要影響因素，每個因素取2個水平，低水平“-1“原始培養(yǎng)條件，高水平”1“約取低水平的1.5到2倍（C源和N源高水平取低水平的2倍），另設3個虛擬列：C、F、J以考察試驗誤差，分別對應于表1。

表 1 Plackett-Burman試驗設計各因素水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman test

在Minitab15環(huán)境下，將各項的取值輸入后，可得到的試驗設計如表2。

表 2 N=12的Plackett-Burman的試驗設計Table 2 Test design of Plackett-Burman（N＝12）

1.6 Box-Behnken設計

根據(jù)Plackett-Burman試驗結果，設計了葡萄糖、豆餅粉、谷氨酸鈉3個因素3個水平的響應面分析，3個因素分別取高濃度“1”中間濃度“0”和低濃度“-1”作為3個水平，三因素三水平的試驗設計共有15個試驗點，15個試驗點可分為兩類：其一是析因點，自變量取值在A，B，C所構成的三維頂點，共有l(wèi)2個析因點；其二是零點，為區(qū)域的中心點，零點試驗重復3次，用以估計試驗誤差。Box-Behnken試驗因素與水平的選取如表3，試驗設計如表4。

表 3 Box-Behnken試驗設計各因素水平Table 3 Factors and levels of Box-Behnken test

表 4 Box-Behnken試驗設計Table 4 Test design of Box-Behnken

1.7 試驗結果驗證

為了驗證響應面法的可行性，考察其擬合程度，采用得到的最優(yōu)培養(yǎng)基配方進行6個批次的發(fā)酵，按1.3方法測定PGA產(chǎn)量。

2 結果與討論

2.1 PGA產(chǎn)量pH時間曲線

從發(fā)酵開始后6 h開始取樣，每隔6 h取樣一次，PGA產(chǎn)量和pH值隨時間變化如圖1。

PGA屬于次級代謝產(chǎn)物，并非菌體生長的必需成分，所以發(fā)酵開始的延滯期和對數(shù)前期（0 h～30 h）幾乎不產(chǎn)生，在對數(shù)生長末期（30 h）開始分泌，在36 h～42 h生成量增長最快，在42 h后達到最多，然后平穩(wěn)到55 h后有所下降。由圖1可知選擇40 h～50 h停止發(fā)酵比較合適，我們后面實驗統(tǒng)一采取42 h。由發(fā)酵液的pH變化曲線可以看出，當菌體在發(fā)酵初期由于糖類代謝旺盛pH會下降，到了24 h左右初級代謝進入穩(wěn)定期，次級代謝產(chǎn)物的生成會使pH稍有生高，到6.0左右，由圖1可以發(fā)現(xiàn)，pH的第2個下降時間點與PGA大量產(chǎn)生的時間幾乎同步，然后可能由于PGA的大量生成，pH將會再次下降直至5.5，所以可以由發(fā)酵液的pH變化了解PGA發(fā)酵的過程，以便于發(fā)酵的測定。

2.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化研究

2.2.1 Plackett-Burman試驗結果分析

選用試驗次數(shù)N=12的實驗設計，若用全因子設計則為八因子二水平的28設計，需256次試驗，實現(xiàn)起來較困難，Plackett-Burman設計篩選的因素的結果見表5。

表 5 Plackett-Burman試驗結果Table 5 Results of Plackett-Burman test

用軟件Minitab對菌體進行析因分析（可信度）90%，做出效應圖，見圖2。

由圖2可以看出影響效應在可信范圍內(nèi)包括葡萄糖，豆餅粉和谷氨酸鈉實驗結果分析如表 6。

方差分析顯示，平方項和交互作用的影響的P值都小于0.05，所以本試驗既存在交互影響又有二次項影響，需要進行響應曲面分析，來確定合理的影響因子的濃度。

2.2.2 Box-Behnken試驗結果分析

按照Box-Behnken設計的試驗15項，PGA的產(chǎn)量試驗結果如表7，結果分析如表8，圖3為殘差分布的分析圖。

表 6 Plackett-Burman試驗結果分析Table 6 The analysis of Plackett-Burman's results

表7 Box-Behnken試驗結果Table7 Results of Box-Behnken test

表8 Box-Behnken試驗結果分析Table8 The analysis of Box-Behnken's results

以PGA產(chǎn)量為響應值Y，豆餅粉濃度設為為X1，谷氨酸鈉為X2，葡萄糖為X3，對表7的試驗結果通過Minitab15進行數(shù)據(jù)分析，各試驗因子對響應值的影響可用下列函數(shù)表示：

由圖3可以看出殘差的隨機分布比較均勻，并且基本呈現(xiàn)正態(tài)，R2=99.12%大于R2（調整）=97.54%說明方程的擬合程度不錯，且沒有再增加試驗點來調整擬合的必要，通過方差分析失擬合P值0.935說明方程的擬合程度是可信的。為了進一步驗證最佳點的值，對回歸方程取一階偏導等于零并整理得：

代入回歸方程，解得預測的PGA的最優(yōu)產(chǎn)量y=3.66 g，換算成單位體積的為26.2 g/L，培養(yǎng)基中豆餅粉質量濃度為32 g/L，谷氨酸鈉質量濃度為48 g/L，葡萄糖質量濃度為80 g/L。

3個因素豆餅粉、葡萄糖和谷氨酸鈉的相互影響，由方程做出二次響應曲面等值線圖如圖4～圖6。

由圖4可見，當谷氨酸鈉的濃度處于中心水平的時，發(fā)酵液中PGA的產(chǎn)量隨葡萄糖，豆餅粉濃度的增加而增加，在二者達到中心水平時產(chǎn)量最大。圖形也證明了3者的影響不僅僅是單一的線性關系，同時表8中P值0.019也說明看出圖形并非線性關系而是二次曲面的圖形，所以對于交互作用的影響應當考慮[12-13]。

圖5 葡萄糖和谷氨酸鈉的的交互作用影響曲面圖（A=0）Fig.5 Response surface plot of PGA production(C=0)as a function of glutamate and glucose

由圖5可見，當豆餅粉的濃度處于中心水平的時，發(fā)酵液中PGA的產(chǎn)量隨谷氨酸鈉，葡萄糖濃度的增加而增加在二者達到中心水平時產(chǎn)量最大。

由圖6可見，當葡萄糖的濃度處于中心水平的時，發(fā)酵液中PGA的產(chǎn)量隨谷氨酸鈉，豆餅粉濃度的增加而增加在二者達到中心水平時產(chǎn)量最大。

2.3 優(yōu)化試驗結果的驗證

按照響應面方法優(yōu)化的最佳培養(yǎng)基配方組成為（g/L）：豆餅粉32，谷氨酸鈉48，葡萄糖80重復試驗6次，結果分別為25.4、26.8、27.6、25.8、24.6、26.6 g與預測值具有較好的擬合性，證明了模型的可行性。

3 結論

試驗證明響應面分析法對培養(yǎng)基優(yōu)化是非常有效的。二水平正交試驗用較少的試驗對多個因素進行考察，通過Plackett-Burman分析對各個因素的效應進行評價，能有效地找出主效因素，分別為豆餅粉、谷氨酸鈉和葡萄糖，其它因素分別固定在各自的最優(yōu)水平上。通過響應面試驗對3個主要因素進一步優(yōu)化，找出最佳值。經(jīng)過響應面方法優(yōu)化的最佳培養(yǎng)基配方組成為（g/L）：豆餅粉32，谷氨酸鈉48，葡萄糖80，在此優(yōu)化的培養(yǎng)基中菌株PGA質量濃度由最初的15.4 g/L提到26.2 g/L，提高了近2倍。

多聚谷氨酸屬于菌體次級代謝產(chǎn)物，在菌體對數(shù)生長末期大量產(chǎn)生，是菌體莢膜上產(chǎn)生的一種對自身具有保護作用的物質，只有在前期生長中營養(yǎng)充足，穩(wěn)定生長的時候才會產(chǎn)生[13]，并且后期菌體生長不利的因素會激發(fā)細胞長生PGA來對自身進行保護，來提高其產(chǎn)量，由于谷氨酸鈉的添加量與PGA的產(chǎn)量不成比例，推測谷氨酸鈉的作用并非是生成PGA的底物，可能是一種前體誘導物。

在發(fā)酵生產(chǎn)中，還可以通過流加培養(yǎng)，來提高發(fā)酵產(chǎn)量；或者通過添加離子來干擾酶的活性，阻遏其它代謝支路，從而提高PGA產(chǎn)量，這些工作需要進一步研究。

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Culture Medium Optimization for Poly Glutamine Production by Response Surface Analysis

WANG Hui1，DONG Chao2，*，SHI Yan－mao2，MA Yue－h(huán)ua2，ZHANG Cong－sha2，YANG Ming3
（1.Hebei University of Technology，Tianjin 300130，China；2.Hebei Institute of Biology，Shijiazhuang 050081，Hebei，China；3.Weisheng Pharmaceutical（Shijiazhuang）Co.Ltd.，Shijiazhuang 050035，Hebei，China）

To optimize the fermentation conditions for poly glutamine by Bacillus subtilis Natto with response surface methodology.Firstly，Plackett－Burman design was used to evaluate the effects of related factors on poly glutamine .It was found that glucose concentration is the most significant positive，followed by concentrations of soybean power and glutamate.And then，the concentrations of glucose，soybean power and glutamate were further optimized using response surface analysis.Results revealed that the optimal medium constituents are as follows：glucose 8%，soybean power 3.2%，glutamate 4.8%.MgSO4·3H2O 0.06%，CaCl20.06%，K2HPO4·3H2O 0.39%，KH2PO40.3%，pH 7.5（before sterilization）.The optimize conditions allow poly－glutamine production to increase from 15.4 g/L to 26.2 g/L.

Bacillus subtilis Natto；Plackett－Burman design；response surface methodology；poly－glutamine

王輝（1984—），男（漢），助理工程師，碩士，研究方向：微生物發(fā)酵。

*通信作者：董超（1970—），男（漢），高級工程師，本科，從事藥用、益生微生物發(fā)酵技術與應用開發(fā)。

2011-03-14