血清藥理學(xué)方法評(píng)價(jià)叔丁基對(duì)苯二酚的安全性

郝鵬鵬，倪晉仁，孫衛(wèi)玲

（1.首都經(jīng)濟(jì)貿(mào)易大學(xué)安全與環(huán)境工程學(xué)院，北京 100070；2.北京大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，北京 100871）

血清藥理學(xué)方法評(píng)價(jià)叔丁基對(duì)苯二酚的安全性

郝鵬鵬1，倪晉仁2，孫衛(wèi)玲2

（1.首都經(jīng)濟(jì)貿(mào)易大學(xué)安全與環(huán)境工程學(xué)院，北京 100070；2.北京大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，北京 100871）

運(yùn)用血清藥理學(xué)方法評(píng)價(jià)食品抗氧化劑叔丁基對(duì)苯二酚的毒性。大鼠灌胃700 mg/kg叔丁基對(duì)苯二酚后，分別于0.08、0.25、0.50、24.00、48.00 h采血，分離血清。以人正常肝細(xì)胞HL7702為研究對(duì)象，采用MTT法檢測(cè)叔丁基對(duì)苯二酚、含叔丁基對(duì)苯二酚及其代謝物血清的細(xì)胞毒性，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)變化。結(jié)果表明：雖然高濃度的叔丁基對(duì)苯二酚會(huì)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，并使細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征改變，但叔丁基對(duì)苯二酚經(jīng)體內(nèi)代謝后的血清對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無顯著性抑制作用。因此，在衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)許可范圍內(nèi)，叔丁基對(duì)苯二酚食用安全。

叔丁基對(duì)苯二酚；安全性評(píng)價(jià)；血清藥理學(xué)；人正常肝細(xì)胞HL7702

合成酚類抗氧化劑叔丁基對(duì)苯二酚（tertiary butylhydroquinone，TBHQ）具有高效的抗氧化性能，并且耐高溫、抗菌[1]。我國(guó)于1991年批準(zhǔn)在油脂制品、堅(jiān)果與籽類罐頭、方便米面制品、餅干、腌臘肉制品、水產(chǎn)品和油炸食品中使用，最大添加量為200 mg/kg[2]。然而，TBHQ的安全性一直存在爭(zhēng)議，并引起社會(huì)廣泛關(guān)注[3]。體內(nèi)試驗(yàn)表明：TBHQ急性毒性低，具有輕微的皮膚刺激性和眼刺激性[4-5]；TBHQ的體內(nèi)代謝物[6-7]有叔丁基對(duì)苯醌、TBHQ-硫酸結(jié)合物、TBHQ-葡萄糖醛酸結(jié)合物、TBHQ-谷胱甘肽結(jié)合物和極性不明代謝物等。體外試驗(yàn)表明：TBHQ[8-14]、叔丁基對(duì)苯醌[12]、TBHQ-谷胱甘肽結(jié)合物[15]具有細(xì)胞毒性。但上述研究仍存局限性：體內(nèi)試驗(yàn)是整體動(dòng)物試驗(yàn)，不能深入解釋TBHQ的毒性作用機(jī)制；體外試驗(yàn)雖然能夠研究TBHQ或某種代謝物對(duì)細(xì)胞的毒性機(jī)理，但是TBHQ經(jīng)體內(nèi)代謝后真正對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性的可能是其他代謝物。近些年，在中藥藥理學(xué)研究領(lǐng)域新興的血清藥理學(xué)試驗(yàn)方法能很好地將體內(nèi)和體外試驗(yàn)相結(jié)合[16]，本文運(yùn)用該方法研究TBHQ經(jīng)體內(nèi)代謝后的毒性，為其安全性評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 材料

成年Sprague-Dawley大鼠[雄性，體重（160±10）g]：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，合格證號(hào)SCXK（京）2002-0003；人正常肝細(xì)胞HL7702細(xì)胞株：中科院細(xì)胞所。

1.1.2 試劑

食品級(jí)TBHQ（>96.0%）：廣州泰邦食品添加劑有限公司；四甲基偶氮噻唑藍(lán)（MTT）、十二烷基磺酸鈉（SDS）：美國(guó)Sigma公司；乙酸乙酯（色譜純）：天津福晨化學(xué)試劑廠；甲醇（色譜純）：美國(guó)Fisher Scientific公司；RPMI1640培養(yǎng)基、新生胎牛血清、胰酶：北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 儀器

高效液相色譜/離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀HP 1100 LC/MSD Trap SL System（配有二元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器和電噴霧電離源）：美國(guó)Agilent公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱：美國(guó)Revco公司；酶標(biāo)儀Multiskan MK3：美國(guó)Thermo公司；倒置相差顯微鏡DIAPHOT-MD：日本Nikon公司；高速離心機(jī)TGL-16C型：上海安亭科學(xué)儀器廠；微型混合器WH-90A型：上海亞榮生化儀器廠；超純水機(jī)MILLI-Q GRADIENT SYSTEM：美國(guó)MILLIPORE公司；電子分析天平BP210S和BP211D：德國(guó)Sartorius公司；一次性尼龍針式過濾頭（0.22μm）：北京北化黎明膜分離技術(shù)有限責(zé)任公司；96孔培養(yǎng)板：美國(guó)Corning公司。

1.2 血清制備

TBHQ的口服半致死量（LD50）為700 mg/kg～1000 mg/kg[6]，本文將劑量設(shè)為700 mg/kg。按體重準(zhǔn)確稱量TBHQ后，制成1 mL玉米油懸浮液灌胃。設(shè)立空白組，以1 mL玉米油灌胃。

大鼠（n＝6） 灌胃后分別于0.08、0.25、0.50、1.00、2.00、3.00、5.00、7.00、9.00、12.00、24.00和48.00 h尾靜脈采血0.2 mL，置于冰盒中，4℃冰箱保存。

血樣在12000 r/min下離心20 min，將上清液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管內(nèi)，即得血清。

1.3 血清分析

1.3.1 樣品前處理

移取血清100 μL至1.5 mL離心管內(nèi)，加入100 μL超純水，振蕩1 min，加入1 mL乙酸乙酯，振蕩3 min，在12000 r/min下離心20 min，移取萃取液800 μL至1.5 mL離心管內(nèi)，氮?dú)饩徛蹈桑?5℃），100 μL甲醇定容，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶?jī)?nèi)，用于TBHQ的分析，在移取萃取液后的殘余液中加入200 μL甲醇，振蕩3 min，在12000 r/min下離心20 min，移取100 μL上清液至進(jìn)樣瓶?jī)?nèi)，用于TBHQ-硫酸結(jié)合物和TBHQ-葡萄糖醛酸結(jié)合物的分析。

1.3.2 儀器分析

液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用條件：詳見參考文獻(xiàn)[7]。

1.4 細(xì)胞抑制率檢測(cè)

1.4.1 溶液配制

MTT溶液（5 g/L）：0.0500 g MTT溶于10 mL磷酸鹽緩沖溶液（PBS），0.22μm微孔濾膜過濾，4℃冰箱保存。

酸性SDS溶液（100 g/L）：10.0000 g SDS溶于100 mL 0.1%的鹽酸。

1.4.2 細(xì)胞培養(yǎng)

TBHQ經(jīng)體內(nèi)代謝后主要分布在腎臟和肝臟中[6]，因此本文選用人正常肝細(xì)胞HL7702為研究對(duì)象，采用含10%熱滅活新生胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天傳代1次。

1.4.3 MTT法

取對(duì)數(shù)期細(xì)胞做試驗(yàn)，緩慢倒出培養(yǎng)基，并將殘留培養(yǎng)基輕輕吸出，加入胰酶1 mL，潤(rùn)洗瓶壁后吸出，加入胰酶2 mL，當(dāng)在顯微鏡下觀察到細(xì)胞大片脫落并將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀時(shí)，加入培養(yǎng)基2 mL，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為2×104cells/mL，以每孔100 μL接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，輕輕吸除培養(yǎng)基，加入含待測(cè)物的培養(yǎng)基100 μL，并設(shè)立對(duì)照組，每一濃度設(shè)3個(gè)平行孔，培養(yǎng)24 h后，輕輕吸除培養(yǎng)基，每孔加入培養(yǎng)基100 μL和MTT溶液10 μL，培養(yǎng)5 h后，加入酸性SDS溶液100 μL，輕輕振蕩，放置12 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度（A），檢測(cè)波長(zhǎng)為540 nm。

1.4.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)或相關(guān)分析，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 采血時(shí)間點(diǎn)的選擇

運(yùn)用液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法研究TBHQ及2種代謝物在大鼠血清中的濃度變化規(guī)律。TBHQ和代謝物TBHQ-硫酸結(jié)合物、TBHQ-葡萄糖醛酸結(jié)合物的質(zhì)譜圖及裂解規(guī)律分別見文獻(xiàn)[17]和[7]。分別以萃取離子流圖（EIC）中TBHQ的二級(jí)質(zhì)譜離子m/z 149、TBHQ-硫酸結(jié)合物的一級(jí)質(zhì)譜離子m/z 245和TBHQ-葡萄糖醛酸結(jié)合物的一級(jí)質(zhì)譜離子m/z 341的峰面積作為其血清濃度高低的判斷依據(jù)。大鼠灌胃700 mg/kg TBHQ后，對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)的血清樣品進(jìn)行分析，得到TBHQ及其代謝物的平均質(zhì)譜峰面積-時(shí)間分布曲線（圖1）：TBHQ、TBHQ-硫酸結(jié)合物及TBHQ-葡萄糖醛酸結(jié)合物濃度達(dá)到峰值的時(shí)間分別為0.25、0.50、0.50 h。因此，本文采集大鼠灌胃后0.08、0.25、0.50、24.00、48.00 h 5個(gè)典型時(shí)間點(diǎn)的血清進(jìn)行血清毒性實(shí)驗(yàn)。

2.2 TBHQ經(jīng)體內(nèi)代謝前、后的毒性

為評(píng)價(jià)TBHQ的安全性，采用MTT法研究TBHQ經(jīng)大鼠體內(nèi)代謝前、后對(duì)人正常肝細(xì)胞HL7702的毒性。

在培養(yǎng)基中添加不同濃度的TBHQ進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明（圖2）：當(dāng)濃度高于0.2 mmol/L時(shí)，TBHQ會(huì)抑制HL7702細(xì)胞的生長(zhǎng)（P<0.05）；隨著濃度的升高，TBHQ的抑制作用增強(qiáng)，當(dāng)濃度高于0.4 mmol/L時(shí)，抑制率達(dá)到70%以上，大部分HL7702細(xì)胞死亡。

以含10%熱滅活新鮮小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基為對(duì)照，當(dāng)培養(yǎng)基中分別添加10%、20%、100%的大鼠空白血清時(shí)，細(xì)胞抑制率分別為（-15.6±11.4）%（P>0.05）、（-19.9±8.2）%（P>0.05）、（-25.4±6.4）%（P<0.05），因此培養(yǎng)基中高比例添加大鼠血清會(huì)促進(jìn)HL7702細(xì)胞的生長(zhǎng)。為避免大鼠血清對(duì)分析的干擾，血清毒性實(shí)驗(yàn)以培養(yǎng)基中添加相同比例的大鼠空白血清為對(duì)照，結(jié)果（表1）表明：A值均無顯著性變化（P>0.05），抑制率低于15%。因此，TBHQ經(jīng)大鼠體內(nèi)代謝后的血清對(duì)HL7702細(xì)胞的生長(zhǎng)無顯著性抑制作用。

表 1 含TBHQ及其代謝物的血清對(duì)人正常肝細(xì)胞HL7702的抑制率Table 1 The inhibition ratio of human normal hepatic cellsHL7702 by the serums containing TBHQ and its metabolites

在倒置顯微鏡下觀察人正常肝細(xì)胞HL7702的生長(zhǎng)狀態(tài)，結(jié)果（圖3）表明：高濃度的TBHQ會(huì)使細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞形態(tài)由不規(guī)則形變?yōu)閳A形；而TBHQ經(jīng)大鼠體內(nèi)代謝后的血清則未使細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化。

3 結(jié)論

運(yùn)用血清藥理學(xué)試驗(yàn)方法對(duì)TBHQ的毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明：雖然高濃度的TBHQ本身具有一定的毒性，抑制人正常肝細(xì)胞HL7702生長(zhǎng)，并改變細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)，但經(jīng)大鼠體內(nèi)代謝后的含TBHQ及其代謝物的血清對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無顯著性抑制作用。

FAO/WHO于1999年規(guī)定TBHQ的每人每天允許攝入量（acceptable daily intake，ADI）為0mg/kg～0.7mg/kg[12]，遠(yuǎn)低于本文采用的劑量700 mg/kg。因此，在衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)許可范圍內(nèi)，TBHQ食用安全，但仍需更為深入的人體代謝研究來證明。

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Safety Evaluation of Tertiary Butylhydroquinone by Serum Pharmacology

HAO Peng－peng1，NI Jin－ren2，SUN Wei－ling2
（1.School of Safety and Environmental Engineering，Capital University of Economics and Business，Beijing 100070，China；2.College of Environmental Sciences and Engineering，Peking University，Beijing 100871，China）

To evaluate the toxicity of tertiary butylhydroquinone，a food antioxidant，the experiment was accomplished by serum pharmacology.After a single gavage dose of 700 mg/kg，the blood samples were taken at 0.08，0.25，0.50，24.00 and 48.00 h，and the serums were separated.Using MTT method，effects of tertiary butylhydroquinone and the serums containing tertiary butylhydroquinone and its metabolites on inhibiting proliferation of human normal hepatic cells HL7702 were respectively studied，and changes of cell morpha were observed with inverted microscope.The results showed that the serums containing tertiary butylhydroquinone and its metabolites had no significant inhibitory effect on the in vitro growth of HL7702 cells，although tertiary butylhydroquinone in the high concentration range significantly had inhibitory effect and changed the cell morpha.Therefore，tertiary butylhydroquinone is safe by oral exposure under the current standards.

tertiary butylhydroquinone；safety evaluation；serum pharmacology；human normal hepatic cells HL7702

郝鵬鵬（1979—），女（漢），講師，博士，研究方向：食品安全。

2011-04-10