西紅花酸對大鼠腦缺血-再灌注氧自由基及一氧化氮的影響*

譚安雄，朱耀斌，王玉銀

(1.邵陽醫(yī)學高等專科學校藥學系，湖南邵陽 422000;2.湖南交通醫(yī)院藥劑科，長沙 410006;3.中南大學湘雅二醫(yī)院，長沙 410011)

西紅花酸(crocetin)是西紅花的主要有效成分之一，具有多不飽和共軛烯酸結構，屬類胡蘿卜素物質。國內外文獻［1-3］報道西紅花酸具有抗動脈粥樣硬化、改善糖尿病血管病變、抗凝血和抗血栓等作用，對心肌缺血損傷有保護作用。西紅花酸對心肌缺血損傷有保護作用，筆者推測其對缺血性腦血管疾病也有一定作用，觀察西紅花酸對腦缺血-再灌注損傷的保護作用，并探討其作用機制。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 清潔級健康雄性SD大鼠120只，體質量260～320 g，購自中科院上海實驗動物中心，動物合格證:SCXK(滬)200920056。

1.2 藥物及試劑 西紅花酸(廣州佳科生物科技有限公司產品，批號:09031210，規(guī)格:每支10 mg);尼莫地平(山東濰坊制藥有限公司產品，批號:090218，規(guī)格:每支5 mg)。丙二醛(malonaldehyde，MDA)測定試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測定試劑盒、一氧化氮(nitrogen monoxidum，NO)測定試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride，TTC)，北京化學試劑公司生產。

1.3 動物分組與給藥 120只SD大鼠適應性喂養(yǎng)5 d后隨機分成6組，即假手術組、模型組、陽性對照組(分別給予尼莫地平溶液5 mg·kg-1)及低、中、高劑量藥物組(給予西紅花酸10，20，40 mg·kg-1)，每組20只。假手術組、模型組給予等容量0.9%氯化鈉溶液。各組大鼠均于每日上午灌胃給予0.9%氯化鈉溶液或相應藥物，每天給藥1次，連續(xù)給藥7次。

1.4 大鼠局灶性腦缺血-再灌注模型的制備 末次給藥1 h后，參照文獻［4］，制備大鼠大腦中動脈阻斷再灌注模型。用10%水合氯醛350 mg·kg-1腹腔注射麻醉大鼠，仰臥固定，消毒皮膚，頸部正中切開，鈍性分離右側頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈。沿頸內動脈向下分離出翼腭動脈，并結扎。用動脈夾夾閉頸總動脈，于頸外動脈上距其始端約2 mm處剪一切口，將一端燙圓的魚線沿頸外動脈緩慢插入至大腦中動脈起始端，略感阻力時停止，插入長度18～22 mm。阻斷中動脈2 h，輕輕拔出魚線至頸外動脈處，使大腦中動脈恢復供血，再灌注22 h。假手術組大鼠分離右側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈及翼腭動脈，結扎翼腭動脈，但不插魚線阻斷大腦中動脈。

1.5 神經損傷癥狀評分 再灌注22 h，每組取10只大鼠。采用ZeaLonga評分法進行神經功能缺陷評分。0分:未觀察到神經功能缺陷癥狀，活動正常;1分:不能完全伸展手術對側前肢;2分:爬行時出現(xiàn)向手術對側轉圈;3分:行走時身體向手術對側傾倒;4分:不能自發(fā)行走，昏迷;5分:死亡。

1.6 腦梗死體積比例測定 神經功能行為缺陷評分后將大鼠斷頭取出全腦，取缺血側大腦，去除小腦、低位腦干和嗅球，將右腦沿冠狀面切成厚度基本相同的5片，腦片置于2%TTC溶液2mL中避光孵育30 min。再將腦片置10%甲醛中固定。數(shù)碼相機攝相后，應用圖像分析儀，測量腦梗死體積比例。

1.7 缺血腦組織中MDA和NO的含量、SOD活性測定 再灌注22 h后，每組取大鼠10只，斷頭處死，取缺血側皮質組織，用0.9%氯化鈉溶液制備10%腦組織勻漿。按照南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說明書測定大腦組織中MDA、NO的含量及SOD活性。

1.8 統(tǒng)計學方法 計量資料以均數(shù)±標準差(x±s)表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間比較采用 LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 西紅花酸對大鼠神經癥狀的影響 假手術組無神經癥狀，模型組有明顯神經癥狀，西紅花酸和尼莫地平能明顯降低大鼠神經缺陷評分，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或 P＜0.01)，見表1。

2.2 西紅花酸對缺血-再灌注大鼠腦梗死體積的影響 與假手術組比較模型組大鼠腦梗死范圍明顯(P＜0.01)。西紅花酸和尼莫地平明顯降低大鼠腦梗死范圍，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)，見表1。

表1 6組大鼠神經功能缺陷評分和腦梗死體積比例Tab．1 The nerve functional defect score and rate of cerebral infarction volume of rats in six groups± s，n=10

表1 6組大鼠神經功能缺陷評分和腦梗死體積比例Tab．1 The nerve functional defect score and rate of cerebral infarction volume of rats in six groups± s，n=10

與模型組比較，*1 P＜0.01，*2 P＜0.05;與假手術組比較，*3 P＜0.01Compared with the model group，*1 P ＜ 0.01，*2 P ＜ 0.05;Compared with sham operation group，*3 P ＜0.01

組別 劑量/(mg·kg-1)神經功能缺陷評分/分腦梗死體積比例/%西紅花酸高劑量藥物組 40 0.35±0.31*1 13.2±4.3*1中劑量藥物組 20 1.21±0.54*2 21.6±3.5*2低劑量藥物組 10 2.04±0.32 34.2±2.7尼莫地平組 5 1.29±0.42*2 20.6±4.2*2假手術組 … 0.00±0.00 0.0±0.0模型組 … 2.12±0.64*3 44.8±3.2*3

2.3 西紅花酸對大鼠缺血腦組織MDA、NO含量的影響 模型組大鼠腦內MDA、NO明顯增多，與假手術組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。西紅花酸和尼莫地平能明顯降低大鼠腦內MDA、NO含量，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)，見表2。

2.4 西紅花酸對大鼠缺血腦組織SOD活性的影響模型組大鼠腦組織SOD活性與假手術組比較明顯降低(P＜0.01)。西紅花酸和尼莫地平能明顯增加大鼠腦內SOD活性，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)，見表2。

表2 6組大鼠缺血腦組織MDA、NO含量及SOD活性Tab．2 The content of MDA，NO and the activity of SOD in ischem ic brain tissues of rats in six groups ±s

表2 6組大鼠缺血腦組織MDA、NO含量及SOD活性Tab．2 The content of MDA，NO and the activity of SOD in ischem ic brain tissues of rats in six groups ±s

與模型組比較，*1 P＜0.01，*2 P＜0.05;與假手術組比較，*3 P＜0.01Compared with themodel group，*1 P ＜0.01，*2 P ＜0.05;Compared with sham operation group，*3 P ＜0.01

組別 劑量/(mg·kg-1)大鼠/只MDA NO μmol·g-1 SOD/(kU·g-1)西紅花酸高劑量藥物組 40 10 2.0±0.5*1 5.8±1.5*1 198.3±13.1*1中劑量藥物組 20 10 2.9±0.4*2 8.8±1.3*2 159.8±10.9*2低劑量藥物組 10 10 3.8±0.7 10.8±2.3 132.4±12.1尼莫地平組 5 10 2.5±0.8*3 8.8±2.1*3 164.3±10.7*3假手術組 … 10 2.1±0.6 6.3±1.1 202.6±12.5模型組 … 10 4.2±0.7*3 12.8±1.3*2 121.1±11.6*2

3 討論

腦缺血-再灌注損傷的機制十分復雜，目前的研究表明其涉及興奮性氨基酸毒性、細胞內鈣超載、氧自由基毒性、炎性損傷及凋亡的表達等，其中氧自由基在腦缺血-再灌注損傷中占有重要地位。腦缺血-再灌注所產生氧自由基通過作用于細胞膜上不飽和脂肪酸，使細胞膜發(fā)生脂質過氧化反應，使質膜破壞和功能障礙;氧自由基可使蛋白質的巰基氧化，形成二硫鍵，直接損傷蛋白質的結構，抑制蛋白質的功能;氧自由基還可使DNA斷裂，破壞核酸及染色體的結構和功能。

腦缺血-再灌注后，大量的氧分子為黃嘌呤氧化酶的核苷酸代謝提供了底物，導致過氧化氫和超氧化物過量產生，自由基清除酶活性降低，消除自由基的功能減弱，使自由基與清除自由基酶之間的平衡失調。MDA是脂質過氧化物中的主要產物，測定MDA可反映機體內脂質過氧化的程度。SOD為抗氧化酶，是體內主要的自由基清除劑，能催化超氧自由基發(fā)生歧化反應，保護細胞免受損傷。SOD活力的高低反應機體清除氧自由基的能力，常作為清除氧自由基能力的主要指標。因此，通過測定SOD、MDA可反映腦缺血-再灌注后自由基對腦組織的損傷情況［5］。

NO在腦缺血發(fā)病過程中有雙重作用［6］。缺血早期血管內皮細胞中的結構型一氧化氮合酶(cNOS)介導產生少量的NO，可擴張血管和抑制血小板聚集，改善腦組織灌流，對缺血腦組織有保護作用。再灌注時，神經膠質細胞中的誘導型一氧化氮合酶(iNOS)介導產生大量的NO則具有神經毒性，可直接或者通過其衍生物導致能量耗竭，損害DNA，抑制DNA合成，誘導細胞調亡。NO可與氧自由基協(xié)同作用，導致細胞內鈣超載、興奮性氨基酸細胞毒性作用和酸中毒等一系列變化，導致神經細胞損傷。

本實驗顯示，模型組大鼠腦缺血-再灌注后出現(xiàn)明顯的神經功能障礙、腦梗死范圍大，MDA、NO含量增加，SOD活性降低。西紅花酸治療組與模型組比較，神經功能明顯改善、腦梗死范圍明顯減小，MDA、NO含量降低，SOD活性增加。表明西紅花酸對腦缺血-再灌注損傷有保護作用，其作用機制可能與提高腦內SOD的活性和降低腦內MDA、NO含量有關。

［1］ 寇鑫暉，錢之玉.西紅花酸對大鼠心肌缺血-再灌注損傷的保護作用［J］.中草藥，2008，39(7):1049-1053.

［2］ 彭飛城，皋聰，錢之玉.西紅花酸對小鼠低氧損傷的保護作用［J］.中國新藥雜志，2007，16(21):1772-1775.

［3］ 向敏，錢之玉，周成華.西紅花酸對糖尿病大鼠體內晚期糖基化終產物的形成及其受體表達的影響［J］.中國臨床藥理學與治療學，2006，11(4):448-452.

［4］ LONGA E Z，WEINSTEIN P R，CARLSON S，et al.Reversiblemiddle cerebral artery occlusin without craniect omy in rats［J］.Stroke，1989，20:84-91.

［5］ 王培源，王海萍，李光武.葛根黃酮對大鼠腦缺血-再灌注損傷的保護作用［J］.中國中藥雜志，2006，31(7):577-579.

［6］ 張麗娟，孔軍伶.山茱萸多糖的提取工藝優(yōu)化及對大鼠局灶性腦缺血-再灌注損傷的保護作用［J］.中藥材，2007，30(11):1466-1468.