抗結核桿菌人源噬菌體單鏈抗體庫的構建及篩選

何光志，田維毅，高 英，王 平，王文佳，王乾宇，黃 高，安傳偉

(1.貴陽中醫學院，中國貴陽 550002;2.遵義醫學院附屬醫院，中國遵義 563003)

抗結核桿菌人源噬菌體單鏈抗體庫的構建及篩選

何光志1*，田維毅1，高 英2，王 平1，王文佳1，王乾宇1，黃 高2，安傳偉1

(1.貴陽中醫學院，中國貴陽 550002;2.遵義醫學院附屬醫院，中國遵義 563003)

目的:構建人源噬菌體展示單鏈抗體(ScFv)庫，篩選抗結核桿菌特異性、高親和力的ScFv.方法:從結核患者的外周血淋巴細胞中，提取RNA并通過RT-PCR擴增出VH和VL基因，并采用SOE-PCR構建ScFv基因，將其克隆入噬粒載pCANTAB5E中，轉化于大腸桿菌TG1，通過輔助噬菌體M13K07援救構建噬菌體單鏈抗體庫.結果:初級庫庫容量為3.5×106，在大腸桿菌TG1中重組后得到2.6×106的次級抗體庫.結論:成功構建噬菌體展示ScFv庫并獲得人源抗結核桿菌特異性ScFv，為進一步研制抗抗結核桿菌的高特異性、高親和力的基因工程抗體奠定了基礎.

結核桿菌;人源噬菌體單鏈抗體;制備及篩選

結核分枝桿菌(Mycobacterium Smegmatis)是引起結核病的病原菌，也稱結核桿菌.可侵犯全身各器官，但以肺結核為最多見.目前全球約有20億肺結核帶菌者，現癥結核患者2 000萬，每年有1 000萬人新發病和300萬人死亡.我國結核患者人數居世界第二位，全國1/3的人口曾受到結核菌的感染［1］.

噬菌體抗體庫技術是抗體工程領域的最重要進展，各種小分子抗體相繼產生，在疾病的診斷與防治、自身免疫性疾病與病毒性疾病的鑒別研究、腫瘤的影像分析和導向治療或基因治療等多個領域有著潛在的優勢.該技術具有簡單易行、生產成本低、篩選容量大等優點［2］.本研究嘗試利用噬菌體展示技術構建大容量天然人源性噬菌體抗體庫，從中篩選出結核桿菌的人源性單鏈抗體(single chain Fv fragment，scFv)，為進一步研制抗結核桿菌的特異性的基因工程抗體奠定了基礎.

1 試劑

100 mL外周血來自10例康復1月的結核患者(遵義醫學院附屬醫院檢驗科提供)，淋巴細胞分離液，購自上海華精生物高科技有限公司.總RNA抽提試劑盒(TRIzol.R.Total RNA Isolation.Reagent)、逆轉錄試劑盒(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)，GIBCOBRL 公司產品;DNA Purification System，Promega，公司產品;100 bp DNA Ladder，SfiⅠ和NotⅠ限制性內切酶、Taq DNA聚合酶和T4 DNA連接酶，購自大連寶生物公司;噬菌粒載體pCANTAB-5E、輔助噬菌體M13K07、大腸桿菌E.coliTG1、HRP/抗M13單克隆抗體，Amersham公司產品;結核桿菌抗原(批號:984010)，購自上海晶瑩生物制品公司.

2 方法

2.1 人源抗體VH和VL基因的PCR擴增

以合成的cDNA為模板，VHf和VHr引物等物質的量混合擴增VH基因，Vκf/Vκr和Vλf/Vλr不同引物等物質的量混合液擴增VL基因.VL的PCR反應條件為:95℃預變性10 min;94℃ 60 s，66℃ 30 s，72℃30 s，共30個循環;最后72℃延伸10 min.VH的退火溫度為65℃，其他反應條件同VL.PCR產物經20 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，切膠回收目的基因片段.

2.2 ScFv基因的構建

通過重疊延伸拼接法將VH和VL基因拼接成ScFv基因.取純化的VH和VL基因片段經94℃ 40 s，55℃ 1 min，72℃ 1.5 min，10個循環后，加含有酶切位點的引物VHf(SfiⅠ)和VLr(NotⅠ)，94℃ 30 s，66℃45 s，72℃ 90 s，35個循環.PCR產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收.

2.3 噬菌體抗體庫的構建

將上述PCR產物ScFv純化回收，用SfiⅠ和NotⅠ進行酶切，與經同樣雙酶切的表達載體pCANTAB5E用T4 DNA連接酶，電轉化大腸桿菌TG1，鋪SOBAG平板.用2×YTAG培養基洗脫菌落，稀釋至A600=0.5，加入輔助噬菌體M13K07繼續振搖1 h，離心后用2×YTAK培養基重懸后振搖過夜，次日離心收集上清，加入1/5體積的PEG/NaCl溶液，冰浴，離心，重懸沉淀即為噬菌體ScFv庫，過濾后于4℃儲存備用.

2.4 抗體庫的重組率測定、酶切鑒定和多樣性分析

取適量抗體庫接種在20 mL 2×YT-ATK(含10 g/L Glucose，100 mg/L Amp及20 mg/L Tet)培養基中，37℃，振搖培養至A600=0.68，加入輔助噬菌體M13K07于37℃靜置60 min;4℃，3 500×g離心15 min，沉淀重懸于20 mL 2×YT-ATK(含100 mg/L Amp，20 mg/L Tet，70 mg/L Kan)中培養過夜;在4℃條件下，8 000×g離心15 min，上清用40 g/L PEG-8000和30 g/L NaCl沉淀，4℃，10 000×g離心30 min棄上清，離心管倒置除去PEG液;沉淀用適量的PBS重懸，移入另一離心管，反復吹打混勻，10 000×g離心5 min，上清即為噬菌體抗體庫，檢測庫容.用SB培養液將所制備的噬菌體抗體庫進行10倍系列稀釋，分別加入100 μL大腸桿菌TG1(A600=1)，室溫下感染20 min，涂SOBAG平板(含100 mg/L Amp)，于37℃過夜培養，次日計數噬菌落形成個數，計算噬菌體抗體庫的庫容，4℃保存.

從SOBAG平板上隨機挑取15個單菌落，進行PCR擴增用瓊脂糖凝膠電泳檢測ScFv的重組情況;提取PCR鑒定為陽性單菌落的質粒，用SfiⅠ和NotⅠ進行雙酶切，采用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析酶切圖譜;隨機挑取陽性克隆，采用PCR擴增ScFv基因片段，電泳回收后，用BstNⅠ酶切，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析酶切圖譜.

2.5 噬菌體抗體庫的篩選

用包被液稀釋結核桿菌抗原1 μg/mL包被96孔ELISA板，100 μL/孔，含30 g/L BSA的PBS封閉，PBS洗滌后，加入噬菌體抗體庫100 μL，37℃溫育2 h;吸去噬菌體抗體液，以PBST洗滌1次(第2輪洗滌5次，第3～5輪洗滌10次)，PBST洗滌1次，加入100 μL洗脫液［含0.1 mol/L HCl(pH2)和1 g/L BSA］，于室溫靜置10 min;將洗脫液稍加吹打后吸出，立即用6 μL 2 mol/L Tris中和，加入2 mL大腸桿菌E.coliTG1，37℃靜置20 min，加入20 mL SB(含氨芐西林和四環素)，37℃培養2 h;加入M13K07、卡那霉素.進行5次反復淘洗，收集沉淀.特異性噬菌體抗體得到高度富集.

2.6 ScFv的特異性鑒定

將第5輪篩選后洗脫的噬菌體感染大腸桿菌TG1，涂于SOBAG平板，過夜培養后，隨機挑選細菌菌落接種于4 mL含Amp和四環素的SOBAG培養基中，37℃振蕩培養過夜;取200 μL，加至4 mL含相同抗生素的SOBAG中，37℃振蕩培養2 h后加入40 μL M13K07，培養2 h;再加入Kan至70 mg/L，30℃振蕩培養12～16 h離心收集上清，即為單克隆噬菌體抗體，4℃保存.將待檢噬菌體抗體與等量10 g/L BSA混合，室溫孵育20 min，加至經抗結核抗原包被和BSA封閉的ELISA板中，于37℃溫育2 h，用PBST洗板4次，PBS洗滌2次后，以HRP標記的M13噬菌體單克隆抗體進行結合反應，TMB顯色.

3 結果

3.1 抗體重鏈和輕鏈可變區基因的PCR擴增

以提取出的RNA為模板逆轉錄合成cDNA第一鏈后，再以cDNA為模板進行PCR反應分別擴增抗體基因重鏈和輕鏈可變區.產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，分別在300～400 bp間出現條帶，結果見圖1.

3.2 單鏈抗體可變區片段(ScFv)的組裝和全長擴增

采用SOE-PCR的方法將抗體輕、重鏈可變區基因組裝成ScFv片段，經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳證實，組裝后的ScFv基因在700～800 bp間出現條帶 (圖2).

圖1 VH和VL基因RT-PCR擴增產物電泳分析

圖2 ScFv基因PCR擴增產物電泳分析

3.3 抗體庫的庫容、重組率測定及酶切鑒定

構建的初級抗體庫經(庫容=涂板后生長出的噬菌斑數數目/涂板菌液量/涂板菌液稀釋的倍數)計算，初級庫容量為3.5×106.隨機挑取20個菌落，經PCR鑒定表明，重組率為80%，故次級庫的庫容量為2.6×106;陽性質粒做雙酶切鑒定，電泳示在700～800 bp間出現條帶(圖3).

3.4 抗體庫的多樣性

隨機挑取的10個單克隆，經PCR擴增ScFv基因片段，電泳回收后，以BstNⅠ酶切，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，抗體庫中抗體分子的多樣性良好，見圖4.

圖3 重組質粒pCANTAB5E–ScFv雙酶切鑒定

圖4 單克隆的BstNⅠ酶切圖譜

3.5 噬菌體抗體庫的篩選

將抗結核桿菌抗原噬菌體抗體庫進行5輪“吸附-洗脫-擴增”的篩選.可以看到隨著洗滌次數的增加，噬菌體抗體的收獲率增加，經過5輪篩選增加約110倍，表明噬菌體抗體庫得到富集(見表1).

表1 結核桿菌抗原對噬菌體抗體的富集

3.6 噬菌體ScFv特異性的初步鑒定

從第5輪篩選得到的菌落中隨機挑選20個克隆，制備噬菌體抗體，經ELISA檢測，陽性克隆孔中液體顯色，陰性孔中液體不變色.顯色后，陰性對照孔450 nm時A值為0.076，15株ELISA的A值較高，呈現陽性反應，其450 nm時A值分布于0.256～0.532之間，陽性克隆檢出率約為75%.對其中12號陽性克隆的可變區DNA序列和氨基酸進行分析，結果該克隆重鏈可變區與GenBank中登錄的免疫球蛋白IgG重鏈可變區VH3有92%同源性，κ可變區與V-J4有92%同源性.表明12號陽性克隆為抗結核桿菌抗原噬菌體抗體.

4 討論

噬菌體抗體庫技術是采用PCR的方法將B細胞全套可變區基因克隆出來，與噬菌體包膜蛋白融合表達，從而展示于噬菌體表面，即可建成噬菌體抗體庫.ScFv的基本結構為VH-Linker-VL或VL-Linker-VH，由于ScFv抗體分子量只有全抗體的1/6，抗體只有可變區片段，不含恒定區，免疫原性較低，故易于穿過血管壁和組織屏障，沒有Fc段，所以減少了與組織的非特異性結合，同時保留了與抗原結合的特異性和親和性，具有結構簡單，易于大規模生產，成本低等優點，因此在臨床、科研、工業和新藥設計等領域均具有誘人的應用前景［4-6］.

ScFv抗體在感染性疾病的診斷與防治、自身免疫性疾病與病毒性疾病的鑒別研究、腫瘤的影像分析和導向治療或基因治療、新型藥物設計等多個領域發揮著越來越重要的作用［7-13］.目前，在多種噬菌體抗體庫的構建，并從其中篩選出多株具功能活性的小分子抗體，如抗HBV、HIV、RSV、TNF、erbBZ和gpl20等單鏈抗體或Fab抗體［14-17］，有些已進入了臨床I/II期試驗.人源抗體的問世徹底解決了小分子抗體的人源化問題，極大地推動了人源抗體的研究及應用［18-20］.

抗體重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)基因由相對保守的骨架區和能夠根據不同抗原做出相應變化的抗體互補決定區(CDR)組成，雖然抗體分子可變區有著數量巨大的多樣性，但其骨架區的序列和前導序列相對保守，所以抗體可變區PCR引物的設計應可能考慮親本抗體可變區序列的完整性和真實性.庫容量大小影響抗體庫質量的最主要因素，而基因的多樣性是決定庫容量大小，其直接決定了接下來篩選高親和力的單鏈抗體［21］.因為淋巴細胞含目的抗體基因的mRNA是高豐度，有利于所建文庫被篩選及克隆出高親和力的抗體，所以選用淋巴細胞建庫較好［3］.本研究擴增設計可變區引物時引用路艷等的工作［3］，通過提取患者康復后的外周淋巴細胞總RNA，經RT-PCR分別擴增出H鏈和L鏈可變區基因，將VH和VL片段隨機拼接成ScFv片段克隆至pCANTAB5E載體，并轉化至感受態TG1菌，經輔助噬菌體M13K07拯救，獲得人源抗結核桿菌噬菌體展示單鏈抗體庫，本研究為結核病的預防、診斷、治療等研究奠定了基礎.此研究為結核臨床防治研究奠定了基礎.

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Construction and Screening of Human Single-chain Antibody Library of Anti-Mycobacterium Smegmatis

HE Guang-zhi1*，TIAN Wei-yi1，GAO Ying2，WANG Ping1，WANG Wen-jia1，WANG Qian-yu1，HUANG Gao2，AN Chuan-wei1
(1.Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550002，China;2.Affiliated Hospital of Zunyi Medical College，Zunyi 563003，China)

Aim:To construct a human phage-displayedsingle-chain Fvantibody(ScFv)library and screen specificScFvagainstMycobacterium Smegmatis.Methods:The total RNA was extracted from peripheral blood lymphocytes in patients withMycobacterium Smegmatis，first strand cDNA synthesis was performed using a cDNA synthesis kit and an oligo(dT)-18 primer.To human immunoglobulin H chain and L chain variable region of degenerate primers，cDNA first strand as a template，were amplified H chain and L chain variable region genes.SOE-PCR method to VH and VL fragments were assembled intoScFvfragments and then cloned into pCANTAB5EScFvvector and transformed into competent TG 1 electric bacteria by helper phage rescue M13K07 getMycobacterium Smegmatissingle chain antibody phage display library.Results:A primary library of 3.5×106and a second library of 2.6×106were constructed.Conclusion:The results lay a solid foundation for preparation of human engineering antibody toMycobacterium Smegmatisreported herein with higher affinity.

Mycobacterium Smegmatis;human single-chain antibody;construction and screening

R378.91+1

A

1000-2537(2011)05-0070-05

2011-04-26

貴州省2011年社會發展科技攻關資助項目(黔科合SY字(2011)3020)

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，E-mail:heguangzhi7711@sina.com

(編輯 王 健)