DNA甲基化與結直腸癌

文 玉（綜述），李曉燕（審校）

（昆明醫學院第一附屬醫院消化內科，昆明 650032）

結直腸癌是較為常見的惡性腫瘤，發病率呈逐年上升趨勢。據統計，世界范圍內2007年新增結直腸癌病例數為120萬，當年因結直腸癌致死人數達60萬［1］。在美國，2010年可能約有569 490人死于癌癥，即每日約有1500人死于癌癥;男性和女性的腫瘤患者在結直腸癌的發病率和病死率均位列第三位［2，3］。結直腸癌在中國也是最常見的惡性腫瘤之一。結直腸癌發病率居高不下的原因之一就是缺乏行之有效的早期檢測方法。隨著表觀遺傳學的發展，DNA甲基化與腫瘤的關系是目前研究的熱點。腫瘤的發生及發展中存在一系列甲基化水平的改變，因此，對于某些特異性的異常甲基化的檢測，可成為早期診斷腫瘤的特異分子指標。

1 DNA甲基化與表觀遺傳學

表觀遺傳學的概念是1942年由Waddington提出的。表觀遺傳學是指DNA序列不發生變化，但基因表達卻發生了可遺傳的改變。換言之，這種可遺傳的變化是指細胞內除可遺傳信息外的其他可遺傳物質的改變，且這種改變在發育和細胞增殖中能穩定地傳遞下去，如DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質重塑和RNA干擾等。表觀遺傳學是從DNA水平、蛋白質水平、染色質水平及RNA水平等多個水平調控基因的表達［4］，而上述幾個水平之間是相互關聯的。

DNA甲基化是目前研究最多、最清楚的一種原核和真核生物普遍存在的表觀遺傳學調控機制。DNA甲基化一般與基因的沉默相關，非甲基化則一般與基因的活化相關，而去甲基化往往是與一個沉默基因的重新激活相關［5］。DNA甲基化是在DNA甲基轉移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的催化下，將作為甲基供體的S-腺苷甲硫氨酸結合到胞嘧啶5位碳原子上，生成5-甲基胞嘧啶的過程［6］。研究表明，DNA甲基化是抑制基因活性的一個重要機制，DNA甲基化是從堿基突變、抑制轉錄水平基因表達及染色體的不穩定性等方面影響基因表達，而轉錄水平抑制基因表達的作用目前研究得較多。

DNA甲基化抑制基因轉錄的機制有:①DNA的胞嘧啶發生甲基化后，DNA的空間構象發生改變，從而影響了轉錄因子與DNA的結合;②甲基化的DNA與 CpG結合蛋白（methyl-CpG binding proteins，MeCPs）結合，改變了染色質的結構，從而抑制了基因的轉錄;③序列特異性甲基化連接蛋白與啟動子區甲基化CpG島結合，組織轉錄因子與啟動子區靶序列的結合，從而影響了基因的轉錄［7］。

DNMT在甲基化中的作用也不容忽視。目前所知的DNMT有3類（5種），分別是 DNMT1、DNMT2和 DNMT3（DNMT3a、DNMT3b 和 DNMT3L）。DNMT1主要維持甲基化狀態，是非CpG位點從頭甲基化所必需，并參與甲基化狀態的延伸，即是復制后維持甲基化的關鍵酶［8］。目前對于DNMT2的認識尚少，DNMT2在組織內主要分布于肌肉、發育中的胚胎內臟、卵巢囊腫及增殖中的睪丸細胞［9］，研究認為其DNA甲基化酶活性非常弱，且識別位點并非CpG，因此在體外實驗中常常難以觀測到其DNA甲基化酶 活 性［10］。DNMT3 包 括 DNMT3a、DNMT3b 和DNMT3L，主要參與從頭甲基化，是從頭甲基化酶，對CpG位點的側翼序列有一定的傾向性，研究顯示其3種亞型間具有相互影響及協同作用［11，12］。

2 結直腸癌中的DNA甲基化改變

正常的DNA甲基化對于維持機體的功能是必需的，如基因印跡、X染色體失活、細胞分化和胚胎發育等［12］，而異常的DNA甲基化則會引發疾病甚至腫瘤的發生，異常CpG的重新甲基化常被認為是人類腫瘤發生的一個早期特征［13］。結直腸癌中，基因不穩定性主要分為:微衛星不穩定、CpG島甲基化表型和癌基因突變［14］。而DNA甲基化多表現為甲基化水平降低（包括整個基因組的廣泛低甲基化、癌基因的低甲基化及未甲基化CpG島的重新甲基化）和某些特定區域發生的高甲基化（即區域性高甲基化）。

2.1 低甲基化 低甲基化通過以下途徑誘發腫瘤:①低甲基化誘導產生內源性反轉錄病毒物質，這些物質可插入激活原癌基因;②低甲基化可通過表觀遺傳效應激活原癌基因;③低甲基化可導致基因組不穩定性。有研究表明，在許多腫瘤中，細胞整體呈現低甲基化水平，隨著病情的惡化，低甲基化程度則會逐漸加強［13］。

2.2 高甲基化 區域性高甲基化發生的特定區域一般為跨越管家基因和腫瘤抑制基因啟動子的CpG島區，由于其能誘導基因編碼區突變或使基因失活而利于腫瘤的發展。目前已經鑒定出的在不同腫瘤中易發生高甲基化的基因包括參與細胞周期調控、信號轉導通路、凋亡、DNA錯配修復、血管生成抑制、腫瘤轉移及浸潤、耐藥性形成等基因。而這種基因水平的改變與基因剔除和基因突變等不同，可以被DNMT抑制因子逆轉，從而恢復正常甲基化狀態［15］。

2.3 結直腸癌中甲基化異常的基因 1999年，Toyota等［16］在結直腸癌中發現了一組高甲基化聚集的特殊CpG島甲基化表型，是多個基因同時發生轉錄失活，引起基因外不穩定的一種通路，在結直腸癌形成的后期起著重要作用。一系列研究表明，結直腸癌中的5-甲基胞嘧啶較正常組織水平低，而對于p16（即 MTS，multiple tumor suppressor 1）、錯配修復基因 1（human mutL homolog 1，hMLH1）和 MINT（Msx2 interacting nuclear target protein）位點甲基化水平的檢測發現，其廣泛低甲基化主要發生于結直腸癌早期。廣泛低甲基化可以增加某些基因的表達水平，如癌基因c-myc、K-ras以及結直腸癌中S100鈣調蛋白 A4 基因等［17］。Liu 等［18］報道，在 78% 的結直腸癌組織中和13%的癌旁組織中檢測出A激酶錨定蛋白 12（A-kinase anchoring protein12，AKAP12）啟動子的甲基化，而近來的一些研究表明，在收集到的結直腸癌患者和正常人血液中檢測出 AKAP12，各占48%和8%［19］。Okada 等［20］研究認為，在結直腸癌中TWIST1（twist homolog 1）基因超甲基化是較為常見的，而且它的高表達會進一步造成結直腸癌的惡化。

3 DNA甲基化與結直腸癌早期診斷、檢測及治療

3.1 結直腸癌早期診斷 提高結直腸癌的早期診斷率可以明顯改善臨床整體治療效果，對于患者預后具有重要意義。很多CpG島甲基化事件已成為腫瘤早期診斷的分子靶標，而CpG島超甲基化可能會是一個很有前景的早期診斷腫瘤的指標。Esteller等［21］報道，在48例平坦型結直腸癌患者中的39例檢測到RAS相關區域家族1A基因（Ras association domain family 1A gene，RASSF1A）的啟動子超甲基化，結果顯示RASSF1A的啟動子超甲基化是一個在平坦型結直腸癌發病早期的頻發分子事件，并且隨后一系列RAS基因（Ras gene）轉導路徑的異常與平坦型結直腸癌的形態和侵襲性有關。Nishio等［22］認為，人類Runt相關轉錄因子3（human runt related transcription factor 3，RUNX3）可作為診斷結直腸癌的一種新的血清標志物。Liu等［23］也發現鼻咽癌細胞相關基因6（nasopharyngeal carcinoma associated gene 6，NGX6）介導的啟動子甲基化是一個潛在的結直腸癌分子標志。Model等［24］運用微陣列分析和反轉錄-聚合酶鏈反應分析等技術，篩選出高度甲基化結直腸癌序列，其中的TMEFF2基因（transmembrane protein with EGF-like and two follistatin domain gene）、表皮生長因子受體基因和ZDHHC22基因（zinc finger，DHHC domain containing 22）等標志物具有高度特異性，并且可用于檢測血液或糞便樣本，可作為結直腸癌的非侵入性診斷方法［24］。deVos等［25］指出，檢測血漿中的SEPT9基因（septin 9 gene）可用于診斷結直腸癌，而Huang等［26］在結直腸癌患者糞便標本中檢測出分泌型卷曲相關蛋白2的超甲基化，認為其可作為早期診斷結直腸癌的一種方法［26］。隨著深入研究，DNA甲基化將會在結直腸癌早期診斷中發揮重要作用。

3.2 DNA甲基化的檢測方法 檢測DNA甲基化的主要途徑有:①用于甲基化敏感的限制性內切酶來鑒別是否甲基化;②因亞硫酸氫鈉可轉換未甲基化的胞嘧啶為尿嘧啶，故可用亞硫酸氫鈉處理DNA，則發生甲基化DNA的胞嘧啶將不被替代。主要的實驗方法有:甲基化敏感的限制性內切酶聯用Southern印跡雜交（Southern blotting）、限制性內切酶消化后進行聚合酶鏈反應、亞硫酸氫鈉處理DNA后測序、甲基化特異聚合酶鏈反應、甲基化敏感單核苷酸引物延長法和亞硫酸氫鈉聯合限制性內切酶分析法等。

3.3 DNA甲基化與結直腸癌的治療 DNA甲基化是可逆的動力學過程，因此，抑制DNMT成為治療腫瘤的一種研究思路，使用DNMT抑制劑，可使腫瘤中甲基化的基因被重新激活［27］。Xiong 等［28］報道，DNMT的作用機制在于通過酪氨酸蛋白激酶/信號轉導和轉錄活化因子3/信號轉導和轉錄活化因子5等信號通路誘導結直腸癌細胞停滯于細胞周期的G2期，繼而發生凋亡，從而抑制了腫瘤細胞的生長。Deng等［29］用5-脫氧氮胞苷處理結直腸癌的LoVo細胞株，發現其可重新激活RUNX3的表達而進一步導致腫瘤細胞的凋亡。Hiraki等［30］研究發現，BNIP3基因（BCL2/adenovirus E1B 19 kDa interacting protein 3）的CpG島甲基化表型可以用于評價聯合運用替吉奧膠囊（S-1）和鹽酸伊立替康（CPT-11）治療結直腸癌患者的療效。

4 結語

隨著基因組測序的完成，表觀基因組學將成為一個全球性研究熱點。結直腸癌的病因及發病機制復雜，而深入研究結直腸癌DNA甲基化模式可從另一角度反映其基因表達狀態，解釋腫瘤的形成和發展機制，對早期診斷及治療提供新的思路。近年來，在DNA甲基化與結直腸癌的關系方面的研究也取得了較多的成果，并隨之出現了很多敏感的檢測甲基化的方法和手段，使得DNA甲基化標志物在臨床的應用成為可能，而且以表觀遺傳改變為靶標的治療有望在不久的將來用于臨床，為結直腸癌的分子治療提供廣闊的前景。

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