一株高產果膠酶青霉菌株的篩選鑒定*

藍麗精， 周 琴， 蔡琪敏， 董夏夢， 汪鵬榮， 蔣冬花

(浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江金華 321004)

能夠分解果膠質的酶稱作果膠酶(pectinase)［1］．該酶可分為:原果膠酶、裂解酶(PL)、多聚半乳糖醛酸酶(PG)和果膠酯酶(PE)［2］．相應地，測量酶活性的方法也有很多，如滴定法、黏度下降法、脫膠作用時間法、還原糖測定法、紫外吸收測定法等．本實驗酶活性測定均采用還原糖測定法中的 3，5-二硝基水楊酸(DNS)法［3］．

果膠酶主要應用于食品加工業，在紡織、環境保護、飼料加工、生物制漿、木材防腐等行業中也有廣泛的應用［4］．文獻［5］還研究了草酸青霉(Penicillium oxalicum)果膠酶的誘導抗病作用．

果膠酶主要由微生物和植物合成．微生物中的真菌、放線菌和細菌［6］都能產生果膠酶的相關酶系．目前國內外研究與應用較多的是細菌和霉菌，其中黑曲霉(Asperillus niger)是國際公認的安全菌株，所以最受關注［7］．此外，酵母菌［8］、鏈霉菌和根霉［9］等也有相關的報道，而關于草酸青霉(Penicillium oxalicum)的相關報道甚少，草酸青霉(Penicillium oxalicum)產果膠酶的液體發酵更是鮮有報道．

果膠酶的傳統工業化生產主要采用固體發酵法，但液體發酵法具有發酵條件參數易于測量、再現性強、易于控制等優點．本實驗從污泥中篩選到一株高產果膠酶的草酸青霉，運用液體發酵法對其酶活性進行了相關研究．

1 材料和方法

1．1 菌株來源

以從山東、四川、海南、浙江等地采集的土壤、昆蟲、動物內臟、腐爛水果等100多份樣品為材料，分離篩選獲得高產果膠酶菌株．

1．2 培養基

1)馬鈴薯葡萄糖培養基(PDA):馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂 15 ～20 g，水 1 000 mL，pH 6．0．

2)產果膠酶篩選培養基:果膠30 g，NaNO33 g，K2HPO4·3H2O 3．3 g，KCl 0．5 g，Fe2(SO4)30．01 g，(NH4)2SO420 g，MgSO40．24 g，CaCl20．15 g，KH2PO43．8 g，瓊脂粉20 g，溴酚藍0．2 g，水1 000 mL，pH 6．0．

3)搖瓶種子培養基:果膠4 g，(NH4)2SO41 g，KH2PO43．8 g，K2HPO4·3H2O 0．2 g，水 100 mL，pH 6．0．

4)搖瓶基礎培養基:桔皮粉4 g，米糠4 g，(NH4)2SO41 g，KH2PO43．8 g，K2HPO4·3H2O 0．2 g，水 100 mL，pH 6．0．

1．3 初篩

取適量土樣、昆蟲、腐爛果實等磨碎后加無菌水，于28℃培養24 h，然后取0．1 mL培養液進行涂布，培養3 d．產果膠酶的菌落著生的藍色培養基有黃色水解圈生成，挑取水解圈明顯的菌落進行復篩［10］．

1．4 復篩

在篩選培養基中挑取水解圈大的單菌落，通過測定和計算其變色圈直徑和菌落生長圈直徑的比值(Dp/Dc)進行復篩．在培養皿的中心分別接入初篩獲得的菌種，接種后培養皿置28℃恒溫培養箱中培養3 d．測量各菌落生長圈的直徑Dc和變色圈的直徑Dp，選擇Dp/Dc值較大的菌種備用，最終選取一株果膠酶活性高的菌株進行實驗．

1．5 搖瓶培養

將復篩獲得的菌種經PDA斜面培養后，用無菌水配成1．0×106的孢子懸浮液，取2 mL(搖瓶裝液量的5%)接入種子搖瓶培養基中，回轉式搖床轉速為160 r/min，28℃培養24 h后，取3．2 mL(搖瓶裝液量的8%)種子液接入搖瓶培養基中繼續培養70 h．搖瓶裝液量均為250 mL三角瓶中裝40 mL．

1．6 粗酶液的提取

發酵液在4℃，10 000 r/min離心10 min，取上清液作為粗酶液．

1．7 酶活性測定

采用 3，5-二硝基水楊酸(DNS)法［3］測定酶活性．吸取0．2 mL適當稀釋的酶液于試管中，加1．8 mL 0．4%的果膠底物溶液，50℃水浴反應30 min后，加2 mL DNS試劑終止反應，沸水浴10 min，冷卻后蒸餾水定容到15 mL，搖勻．空白對照:吸取0．2 mL煮沸的稀釋酶液于試管中，加2 mL DNS試劑和1．8 mL 0．4%的果膠底物溶液，50℃水浴反應30 min，沸水浴10 min，冷卻后蒸餾水定容到15 mL，搖勻．在540 nm波長處測定吸光度．在上述反應體系中，以每毫升果膠酶液降解果膠底物1 min產生1 μg還原糖定義為1個酶活性單位．

1．8 培養時間對產果膠酶的影響

取3．2 mL(搖瓶裝液量的8%)種子液接入40個250 mL裝液量為40 mL的三角瓶內，160 r/min，28℃搖瓶培養，每隔2 h取樣．接著，將菌體一并用濾紙過濾，然后用烘箱于50℃烘至恒重，再用分析天平稱菌絲體干質量．實驗重復3次．

1．9 菌種鑒定

1．9．1 培養和形態特征觀察

將菌株在PDA培養基平板上培養3 d，用顯微鏡觀察其菌絲、分生孢子梗、分生孢子等特征．

1．9．2 DNA提取與ITS序列分析

取PDA培養基平板上培養3 d的新鮮菌絲體50 mg，加液氮研磨成粉末，用試劑盒提取DNA．利用真菌通用引物 ITS1:5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'進行rDNA的內轉錄間隔區(ITS)序列擴增，測序由上海生物工程有限公司完成．將測得的ITS序列在GenBank數據庫進行BLAST比對，通過同源性分析對菌株進行分子水平的鑒定．

2 結果

2．1 產果膠酶菌株的分離篩選

利用產果膠酶的菌株可以使加溴酚藍的培養基產生黃色水解圈的原理，本實驗從土壤、腐爛水果等生境復篩得到黃色水解圈較大的7株霉菌(見圖1和圖2)，對其進行Dp/Dc值及酶活性的測定，結果見表1．

圖1 篩選所獲部分菌落圖

圖2 L5菌株的培養特征和形態特征

表1 7株產果膠酶菌株的Dp/Dc值和酶活性比較

由表1可以看出，菌株的酶活性隨著Dp/Dc值增大而增大，L5菌株的Dp/Dc值最高，相應的酶活性為 39 940 U·min－1·mL－1．L5 菌株是從浙江東陽荷塘淤泥中篩選得到的．圖2(a)為L5菌株在溴酚藍篩選培養基上的黃色水解圈照片．

2．2 培養時間對L5菌株產果膠酶的影響

對每隔2 h取樣得菌體進行干質量測量，并繪制生長曲線見圖3．由圖3可知:將菌體從種子培養基中接入搖瓶培養基約需0～10 h的停滯期;接著10～24 h，菌絲生長，菌體質量進入對數期;其后曲線趨于平緩，24～68 h是菌體質量的穩定期;從68 h始，菌體開始自溶，進入衰亡期．

每隔2 h測量一次L5菌株產生的果膠酶酶活性，以酶活性為縱坐標、培養時間為橫坐標繪制曲線(見圖3)．由圖3可知:在2～70 h內，L5菌株產果膠酶的活性逐漸上升，在菌體穩定期結束時酶活性達到最大值39 940 U·min－1·mL－1;在76～80 h內，果膠酶的活性下降．

圖3 L5菌株的生長曲線

2．3 L5菌株的分類鑒定

2．3．1 形態學鑒定

1)培養特征:PDA培養基上，28℃培養3 d即形成較典型的菌落，菌落中間呈藍綠色，邊緣為白色，直徑約19 mm，輪廓規則，外觀呈絨毛狀．

2)形態特征:28℃ PDA培養基上培養3 d，顯微鏡下觀察L5菌株的菌絲形態、分生孢子梗的分枝情況、帚狀枝及瓶梗的類型等顯微形態特征．由圖2可見:菌絲細胞絲狀交織，具橫隔;分生孢子梗不具足細胞，帚狀枝為對稱雙輪型，瓶梗細長漸變尖銳;分生孢子橢圓形，呈藍綠色．

2．3．2 ITS的PCR擴增與序列分析

用真菌通用引物ITS1/ITS4對L5菌株進行PCR擴增，獲一長度為572 bp的目的片段．將測序所得序列在美國國立生物技術信息中心(NCBI)進行BLAST比對和同源性分析，結果表明L5菌株的ITS序列與Penicillium oxalicum同源性最高達99%．基于L5菌株的ITS序列建立的系統發育樹見圖4，結合形態特征鑒定，將L5菌株鑒定為草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)［11］．

圖4 基于L5菌株的ITS序列建立的系統發育樹

3 討論與結論

果膠酶的研究應用迄今已有70多年的歷史，其用途廣泛，現階段產量已是世界四大酶制劑之一，而中國現有的生產果膠酶工藝存在著很多問題，如固體發酵成本高、生產率低、易染菌等．面對國外果膠酶產品的優勢，我國必須利用豐富的微生物資源，研究新的生產工藝，加緊篩選出擁有自主知識產權、低成本、無污染、滿足市場需求的商業化果膠酶．

本研究從污泥中篩選得到一株高產果膠酶的菌株，對其進行了形態學鑒定，并對其進行了ITS測序，確定其為草酸青霉菌．該菌的ITS序列基因已登錄GenBank，登錄號為:HQ680452．

本研究利用浙江來源豐富的桔皮和米糠作為搖瓶培養基材料，研究表明:該菌株在28℃，培養基初始pH 6．0，轉速160 r/min的條件下，培養70 h果膠酶活性最高，可達 39 940 U·min－1·mL－1;并且，該菌株利用成本低廉、天然、含果膠的植物材料為培養基，不僅實現了廢物再利用，也可以使其高產．可見，對該菌株的研究具有潛在的意義，其應用前景廣闊．

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