高產胞外多糖紅曲菌株的篩選及形態學鑒定＊

汪鵬榮, 劉偉芬, 蔣冬花, 周 琴, 嵇 豪

(浙江師范大學化學與生命科學學院,浙江金華 321004)

真菌多糖是從真菌子實體、菌絲體、發酵液中分離出的由 10個分子以上單糖通過糖苷鍵連接而成的高分子多聚物,是一類可以控制細胞分裂分化、調節細胞生長和衰老的活性多糖,是當今醫藥和食品工業界共同關注的焦點[1].糖生物學已成為生命科學研究領域的新前沿,糖鏈也被稱為生命科學中的第 3條鏈[2].紅曲菌 (M onascus)是一屬小型絲狀腐生真菌,屬子囊菌亞門 (Ascomycotina)不整囊菌綱 (Plectomycetes)散囊菌目 (Eurotiales)紅曲科 (Monascaceae)[3],是一種常用的藥用真菌.我國是世界上紅曲菌生產和應用最早的國家,其中福建古田的紅曲最為有名,浙江、臺灣、兩廣等地區也有生產,特別是浙江省近幾年來在紅曲的生產和應用上有很大的發展.當今國內外對紅曲菌的研究很多,主要集中在莫納卡林 K(Monacolin K)、γ-氨基丁酸 (γ-aminobutyric acid,GABA)和紅曲色素上,但對紅曲菌的另一功能性成分——紅曲多糖的研究卻很少.

目前,國內外對靈芝多糖、香菇多糖、蟲草多糖等進行了廣泛而深入的研究,雖然已有報道表明紅曲多糖同靈芝多糖、香菇多糖、蟲草多糖具有相似的生物學功能,但國內對紅曲多糖的發酵生產工藝的研究較少,尚處于探索階段,而國內相關研究報道的初篩紅曲菌株產胞外多糖的產量均處于較低的水平.本研究希望從浙江省不同地區分布的紅曲米中篩選出高產多糖的紅曲菌株.

紅曲菌屬種傳統的鑒定是以培養特征和顯微形態為主要依據的[4],分類標準的研究有很多.本實驗從浙江省各地采集到的紅曲米中分離純化得到 111株紅曲菌,通過搖瓶發酵篩選出 6株多糖產量相對較高且遺傳穩定性好的紅曲菌菌種,并對其進行了形態學鑒定,以其對后續研究奠定基礎.

1 材料和方法

1.1 菌種及來源

111株紅曲菌的純培養,分離自浙江省各地(溫州、義烏、東陽、金華、杭州等)收集到的紅曲米.

1.2 培養基

1)PDA培養基 馬鈴薯 200 g,葡萄糖 20 g,瓊脂粉 18 g,水 1 000 mL,pH自然.

2)查氏合成培養基 葡萄糖 30 g,NaNO33 g,酵母提取物 1 g,K2HPO41 g,KCl 0.5 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,瓊脂粉18 g,水1 000 mL,pH 6.00.

3)液體發酵培養基 蔗糖 40 g/L,酵母粉4.5 g/L,KH2PO4·3H2O 3.5 g/L,MgSO40.4 g/L,發酵液起始 pH 5.0[5].

4)CYA培養基 蔗糖 30 g,NaNO33 g,酵母提取物 5 g,K2HPO41 g,KCl 0.5 g,MgSO4·7H2O 0.05 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,瓊脂 18 g,水 1 000 mL,pH 6.0[6].

5)G25N培養基 NaNO33.0 g,酵母提取物5.0 g,K2HPO41 g,KCl 0.5 g,MgSO4·7H2O 0.05 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,瓊脂 15 g,補水至1 000 mL,待瓊脂溶化后加入 25%甘油,pH 6.0[6].

6)MEA培養基 麥芽浸出粉 20 g,蛋白胨1 g,葡萄糖 2 g,瓊脂 15 g,補水至 1 000 mL,pH 6.0[6].

1.3 紅曲菌的分離純化

分別取各地采集的紅曲米 0.5 g,用研缽研磨成粉狀,取少量均勻地灑入 PDA培養基表面,30℃培養 48 h左右,待白色絨毛狀菌絲長出后挑取少許菌絲轉接于另一 PDA培養基上繼續培養,培養 1周后重復上述分離純化操作,經 3次純化后即可得到紅曲菌的純培養,將所獲各菌株編號,置 4℃冰箱中保存,備用.

1.4 紅曲多糖的提取

1.4.1 工藝流程[7]

菌種→斜面培養→搖瓶培養→離心除雜→上清液→減壓濃縮→醇沉→離心→沉淀→鼓風干燥→紅曲粗多糖.

1.4.2 種子液的制備

用打孔器 (直徑 0.8 cm)分別取 30℃培養5 d的平板菌種 (5塊)接種到查氏合成培養基(250 mL三角瓶裝入 50 mL查氏液體培養基)中,在 30℃,轉速為 200 r/min的旋轉式搖床培養48 h.

1.4.3 紅曲菌的發酵培養

將上述種子液接種到液體發酵培養基中,接種量為 8%,250 mL三角瓶中裝 100 mL培養液,在 180 r/min,30℃下培養 96 h.

1.4.4 紅曲粗多糖的測定

采用質量法[8].將發酵濾液定容至 100 mL,取 15 mL加入 60 mL無水乙醇中,在 5℃下靜置8 h,過濾,在 80℃烘干 12 h至恒重,稱量.

1.4.5 生物量的測定[8]

紅曲菌經搖床培養后,用 8層紗布過濾,得到的菌體在 80℃下烘干 12 h至恒重,稱量.

1.5 不同菌株菌絲生長速度的比較

采用 PDA斜面培養基,每個菌株接 3個平板,30℃恒溫培養,5 d后測量各菌株的菌落直徑,取平均值作為不同菌株的菌絲生長速度.

1.6 高產多糖紅曲菌株生理生化特征的檢測

1.6.1 生長溫度

將紅曲菌株分別用打孔器接種到麥芽汁瓊脂培養基上,培養溫度分別為 20,25,30,35和40℃,培養 5 d后觀察菌落直徑大小.

1.6.2 生長 pH條件

配制 pH分別為 3,4,5,6,7,8的查氏固體培養基.將紅曲菌株分別用打孔器接種到查氏固體培養基上,30℃培養箱培養 5 d后觀察菌落直徑大小.

1.6.3 碳源

以不含糖的查氏培養基為基礎培養基,供試糖分別為葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、番薯粉、可溶性淀粉、甘油,各種糖的加量均為 3%,配制好培養基后滅菌接種,30℃培養箱中培養 5 d后觀察結果.

1.6.4 氮源

以不含NaNO3的查氏培養基為基礎培養基,供試氮源為 (NH4)2SO4,NaNO3,蛋白胨、牛肉浸膏、酵母粉,在基礎培養基中分別加入不同氮源,加量為 0.3%,配制好培養基后滅菌接種,30℃培養箱中培養 5 d后觀察結果.

1.7 紅曲菌屬種鑒定

將搖瓶發酵篩選出的 6株高產胞外多糖紅曲菌菌種分別接種在上述MEA,CYA和 G25N培養基中,在 25℃培養 7,14和 25 d后觀察記錄菌落生長特征 (如:大小、顏色、表面結構、氣生菌絲、基內菌絲、邊緣特征、生長與否、培養基內可溶性色素等).根據文獻 [4]中紅曲菌分種檢索表,并參考葉硯等[9]和郭紅珍等[10]的描述,對篩選的 6株高產多糖菌株進行形態學鑒定.

2 結果與分析

2.1 紅曲菌種的分離純化

經分離純化,獲得 111株紅曲菌.大部分紅曲菌菌落大而疏松,表層有氣生菌絲,呈絨墊狀,少數為皮膜狀;菌落大多色澤橙紅,少數為白色;菌落邊緣為白色,或淡黃色,背面顏色為深紅色.

2.2 產多糖紅曲菌的初篩

按上述多糖提取方法,對 111株紅曲菌進行產多糖的初篩,結果見圖 1.由圖 1可知,大多數紅曲菌胞外多糖產量都較低,多為 1.0～3.0 g/L(占 72.7%).其中多糖產量在 5.0 g/L以上的只有 6株,分別為編號 MP-25,MP-45,MP-66,MP-70,MP-85和MP-99的菌株.

圖 1 111株紅曲菌胞外粗多糖產量的分布圖

2.3 高產胞外多糖紅曲菌株的復篩

對初篩出的 6株高產胞外多糖的紅曲菌株進行了 3次重復搖瓶發酵實驗,結果 (見表 1)表明:僅菌株MP-66胞外多糖產量最高為 5.28 g/L;而且在重復實驗中發現菌株MP-66的多糖產量穩定在 5.00 g/L以上,而其他 5株初篩高產多糖菌株的胞外多糖產量不是很穩定,有較大幅度波動.因此,選定菌株MP-66為后續實驗的目的菌株.

表 1 6株高產胞外多糖紅曲菌株的平均多糖產量

2.4 菌絲生長速度和生物量的比較

對 6株初篩高產胞外多糖的紅曲菌株在平板培養基上的菌絲生長速度和在發酵液中菌絲體生物量的比較結果 (見表 2)表明:不同菌株在平板和液體培養基中的生長性能存在明顯的差異,有 3個菌株 (MP-25,MP-66和MP-85)在平板培養基上的生長速率較其他菌株快;而在發酵液的生物量方面,菌株MP-45最高達 14.04 g/L,其次為菌株MP-66和MP-25.因此,從菌株的生長速度和生物量方面考慮,并結合其胞外多糖的產量,選取高產胞外多糖的紅曲菌株MP-66用于今后進一步的研究.

表 2 6株高產多糖紅曲菌株平板培養基上生長速度和液體發酵菌絲體生物量的比較

2.5 高產多糖紅曲菌株生理生化特征的比較

2.5.1 菌株生長溫度

從表 3可以看出:6株高產多糖的紅曲菌株在20～40℃均能生長;在 30～35℃生長最快;在20℃下生長緩慢;大多數菌株在 40℃下生長很緩慢,而 MP-66和 MP-70在 40℃仍能較好地生長.由此可見,MP-66和MP-70可能屬于耐高溫型紅曲菌.

2.5.2 菌株生長 pH

從表 4可知,6株高產多糖的紅曲菌株在 pH 3～8均能生長,其最適生長 pH為 5～6.因此,紅曲菌一般在弱酸性環境下培養最好.

2.5.3 菌株碳源利用

由表 5可知:6株高產多糖的紅曲菌株均能較好地利用蔗糖、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉和番薯粉,其中 5株紅曲菌能很好地利用乳糖和番薯粉,只有MP-85的最適碳源為麥芽糖;而對于葡萄糖,這 6株紅曲菌都未能達到最佳生長狀態,原因可能是葡萄糖在滅菌過程中發生了焦糖化作用.MP-25和MP-70能在甘油中生長,其他 4個菌株在甘油中不能生長或者生長得不好.因此,紅曲菌株對甘油的利用情況在紅曲菌的分類鑒定上有一定的參考價值.

表 3 不同溫度下 6株高產多糖菌株的生長情況

表 4 6株高產多糖紅曲菌株在不同 pH條件下的生長情況

表 5 6株高產多糖紅曲菌株的碳源利用實驗結果

2.5.4 菌株氮源利用

由表 6可知,6株高產多糖的紅曲菌株對氮源的利用差別不大,均能利用表 6中的 5種氮源,但它們在有機氮源中明顯較無機氮源中生長更好.

2.6 高產多糖菌株菌落特征和顯微特征的比較

6株高產多糖的紅曲菌株在 CYA,MEA和G25N培養基上 25℃培養 7,14 d后觀察記錄菌落特征.6株紅曲菌在MEA和 CYA培養基上培養 14 d的代表性菌落特征見表 7;在 CYA,MEA,PDA培養基上的代表性菌落特征見圖 2.

表 6 6株高產多糖紅曲菌株的氮源利用實驗結果

表 7 6株高產多糖紅曲菌在MEA和 CYA培養基上的菌落特征 (14 d)

圖 2 6株高產多糖紅曲菌株在 CYA,MEA,PDA培養基上的菌落特征

6株高產多糖紅曲菌株在 30℃下 PDA培養基中培養 7 d,顯微鏡觀察菌絲形態、分生孢子形態及著生方式、閉囊殼特征等顯微形態特征,部分代表性結果如圖 3所示.

由圖 3可見紅曲菌各菌株的典型顯微形態特征:閉囊殼為橢球形 (見圖 3(a)),直徑為 20～50 μm,閉囊殼內散生眾多子囊,成熟后子囊壁解體,孢子剩留在薄壁的子囊殼內;分生孢子梗由菌絲生出,在其頂部產生分生孢子 (見圖 3(b)),形狀為梨形;菌絲直徑 2～7μm,具橫隔,分枝狀,含有空泡和一些色素顆粒 (見圖 3(c)).

圖 3 紅曲菌顯微形態特征

根據 6株高產多糖的紅曲菌株菌落特征和顯微特征,初步將 6株高產多糖的紅曲菌株鑒定為表 8所列的 4個種.

表 8 6株高產多糖紅曲菌株的鑒定結果

3 討 論

本實驗從 111株紅曲菌中最終篩選出一株多糖產量穩定在 5.0 g/L以上的高產多糖紅曲菌株,其平均胞外多糖產量為 5.28 g/L,比目前國內相關文獻報道的高,而且該菌株在平板和搖瓶培養基中的生長速度快,在工業化生產中可以縮短發酵周期、節約生產成本.今后,本課題還將對該高產多糖紅曲菌株進一步研究,提高多糖產量,確定其最佳發酵條件和最佳培養基配方,以期對紅

曲多糖的工業化生產奠定基礎.雖然本文結合了較多的紅曲菌形態學鑒定資料并參考生理生化實驗結果,最終將高產多糖的紅曲菌株MP-66鑒定為紫色紅曲菌,但形態學鑒定由于受環境因素的影響較大,存在一定的主觀性,因此本課題還將從分子水平對該菌株進行屬種的確認.

目前市售的很多保健產品中都含有多糖成分,但大多集中在靈芝多糖和香菇多糖等少數食用菌多糖上.張建峰[11]對紅曲多糖的免疫活性進行了探索,結果表明紅曲多糖同其他真菌多糖一樣具有提高免疫力、保肝解毒等作用.浙江省是國內紅曲分布較多的省份,因此,我們可以充分利用浙江省的紅曲資源,分離純化出高產多糖的紅曲菌菌株,并對其進行屬種的鑒定,為今后進一步研究紅曲多糖的結構和功能的關系、浙江省紅曲菌資源的分布及多樣性打下基礎.

[1]郝瑞芳,景浩.真菌多糖的研究進展[J].中國食物與營養,2008(4):19-20.

[2]張樹政.糖生物學——生命科學的新前沿[J].生命的化學,1999,19(3):104-105.

[3]陳義光,彭德姣,田宏現.紅曲及紅曲霉的研究與應用[J].湖北農學院學報,2000,20(2):188-191.

[4]李鐘慶,郭芳.紅曲菌的形態與分類學[M].北京:中國輕工業出版社,2003.

[5]李霞姣,夏永軍,王鐵軍,等.紅曲多糖液態發酵工藝條件的優化[J].生物加工過程,2009,7(2):13-17.

[6]L I Zhongqing,GUO Fang.A further studies on the species ofM onsacus[J].Mycosystema,2004,23(1):1-6.

[7]陳運中.紅曲色素、多糖與核酸的聯合制備的研究[J].中國釀造,2002(1):26-27.

[8]趙振鋒,方惠英,諸葛健.紅曲霉發酵產胞外多糖工藝的優化[J].無錫輕工大學學報,2002,2(3):289-295.

[9]葉硯,蔣冬花,繆存影.紅曲米和紅腐乳中紅曲菌種的分類與鑒定[J].工業微生物,2009,39(6):38-44.

[10]郭紅珍.山西老陳醋大曲紅曲霉分離鑒定及生物學特性研究[D].太谷:山西農業大學,2004.

[11]張建峰.紅曲多糖高產菌株的誘變篩選及其提取純化免疫活性研究[D].長春:吉林農業大學,2005.